RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em> 체외</em지방 세포 문화> RNA 풀다운
Summary
RNA 풀다운 프로토콜은 RNA 결합 단백질 (RBPs) 및 비 암호화뿐만 아니라 코딩 RNA를 사이의 상호 작용의 검출을 위해 여기에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체 (AR)에서 RNA 조각은 차 갈색 지방 세포의 lystate로부터 RBP를 검색하는 방법을 보여주기 위해 예로서 사용되었다.
Abstract
RNA 결합 단백질 (RBPs)은 지방의 개발 및 기능의 규제 계층으로 부상하고있다. RBPs 대상의 mRNA의 안정성 및 병진 효율에 영향을 미치는하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 역할을한다. RNA 풀다운 기술은 널리기구 RBPs '아니라 긴 비 코딩 RNA를'(lncRNAs) 함수를 기초 해명 할 필요가 RNA – 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 지방 세포에서 높은 지질 풍요 로움이 실험 수행에 기술적 인 도전을 포즈. 다음은 자세한 RNA 풀다운 프로토콜은 기본 지방 세포 배양에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체의 (AR) 3 '번역되지 않은 지역 지방 세포 lystate에서의 RBP 파트너, 허 단백질을 검색하는 방법을 보여주기 위해 예를 들어 사용되는 아데 닐 – uridylate 풍부한 elementwas를 포함 (3'UTR)에서 RNA 조각. 여기에 설명 된 방법의 상호 작용을 검출하기 위해 적용될 수있다RBPs 및 비 암호화 RNA를,뿐만 아니라 사이 RBPs 및 코딩 RNA를.
Introduction
RBPs 세포의 이중 또는 단일 가닥 RNA에 결합하여 RNA – 단백질 복합체 형성에 참여하는 단백질이다. RBPs는 mRNA의 긴 비 암호화 RNA를 (lncRNAs)를 포함하는 RNA 종의 다양한 결합 및 전사 후 수준에서 자신의 영향력을 행사할 수있다. 두 RBPs 및 lncRNAs은 지방 개발 등 새로운 규제를 신흥 1,2,3 작동된다. 이 특정 RNA 분자와 하나 이상의 RBPs 사이의 상호 작용을 검출하는 것이 필요는 RBP- 메커니즘 및 세포질 통로의 lncRNA 매개 규제를 이해하고, 때로는 RNA의 단백질 파트너의 전체 스펙트럼을 식별 할 성적 증명서. 그러나, 실험에 의한 지방 세포에서 지질의 높은 함량에 어려울 수있다. 여기에 설명 된 RNA 풀다운 프로토콜 4,5 차 배양 지방 세포의 용 해물에서 특정 RNA의 단백질 파트너를 검색하기 위해 사용될 수있다.
이 프로토에 대한 이론적 근거다음 COL 요약된다. RNA를 미끼는 DNA 주형으로부터 전사 된 시험관에, 비오틴 – 표지 된 스트렙 타비 딘 – 코팅 된 자성 비드 (4)과 공액. RNA를 미끼이어서 자기 스탠드에서 내려 오게되는 RNA 단백질 복합체의 형성을 허용하는 세포 용 해물과 배양된다. 구체적으로는, RNA 풀다운 프로토콜은 후술 허 단백질 일차 배양 theadipocytelysate에서의 mRNA의 3'UTR 6,7 결합 보편적 RBP 발현을 검색 미끼 AR 3'UTR로부터 RNA 단편을 사용한다. 이 분석의 결합 특이성을 테스트하려면, 비 관련 RNAas 아니라 빈 스트렙 타비 딘 비드 제어 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 특정 RBP의 포착을 확인하거나 캡처 RBPs 각각 8의 전체 레퍼토리를 식별하는 웨스턴 블 롯팅 또는 질량 분석기 (MS)와 호환된다.
몇 가지 기술은 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다에스. 주어진 RBP, RIP (RNA의 면역)와 CLIP (UV 가교 및 면역)에 구속 RNA를 공개하기 위해하는 것은 적용 할 수 있습니다. 반대로, 소정의 RNA의 단백질 파트너를 식별하기 위해, RNA 풀다운는 처프 (RNA 정제하여 염색질 분리) CHART (RNA 타겟 캡처 혼성화 분석)와 RAP (RNA 안티센스 정제)에 적용될 수있다. 나중에 사람과 비교하여, RNA 풀다운 기술은 설정하는 작은 노력이 필요합니다. 생체 외 및 생체 내에서 단백질을 포착하기 위해 사용될 수있다. 그 시험관 대응보다 기술적으로 더 도전 RNA 풀다운,의 생체 방법은 세포에서 가교에 의해 RNA 단백질 상호 작용을 유지, 세포로부터 관심의 앱 타머 – 태그 RNA를 캡처하고,이어서 바인딩 RBPs를 감지합니다. RNA 풀다운 낮은 풍부한 RBPs 농축 및 분리 및 세포 조절을 제어 9,10 다양한 기능적 역할이 RNA 단백질 복합체를 식별하기 위해 사용될 수있다 </s>입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs 및 RBPs 그러나 이러한 분자의 분자 메커니즘을 제대로 이해, 건강과 질병에 중요한 역할을합니다. lncRNA 분자와 상호 작용하는 단백질의 식별 규제 메커니즘을 해명을 향한 중요한 단계입니다. RNA의 풀다운 분석 시스템에 의한 RBPs의 보충은 세포 용 해물로부터 단백질을 선택적 스트렙 자성 비드에 결합 된 비오틴 RNA 베이트를 사용하여 추출 될 수 있도록 복잡한 상호 작용의 인 용액 캡쳐에 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-2011NRF – NRFF001-025)뿐만 아니라 CBRG (NMRC / CBRG가 / 0070 / 2014)에 의해 투자되었다.
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
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