تبوغ الفعال لل<em> خميرة الخباز</em> في تنسيق Multiwell 96
Summary
Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
Abstract
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
Introduction
وقد درس تبوغ في الخميرة في مهدها لتقديم رؤى في جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك السيطرة على الفصل كروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي 1، آليات إعادة التركيب الجيني 2، والسيطرة على التنمية من خلال خلية يشير 3، ومراقبة التغذية التنمية 4، والنسخي تنظيم التنمية 5، والنظر في تشكيل بوغ 6. يتضمن تشكيل بوغ حدث انقسام الخلايا رواية تنطوي على تشكيل المقصورات غشاء جديدة داخل الخلية الأم تليها ترسب جدار بوغ واقية 6. هذه الدراسات أن دراسة الخلايا sporulating في كثير من الأحيان الاستفادة من sporulating بسرعة الخميرة سلالة SK1، والتي يمكن أن تخضع لعملية تكاثر في حوالي 24 ساعة بطريقة فعالة نسبيا 7،8. وعلى الرغم من وصفت تحسين ظروف تبوغ لفي مهدها الخميرة 13/9، هذه التجربةالصورة فحص تبوغ على وسائل الاعلام الصلبة أو في جو من الثقافات السائل على نطاق وحين ينفذ تبوغ من استخدام أنابيب ثقافة أو قوارير.
نحن هنا تصف طريقة لsporulating الخميرة في شكل لوحة multiwell 96. نجد أن لهذا الأسلوب، تهوية أمر بالغ الأهمية للتبوغ متزامن وكفاءة، وقد ابتكرت تقنيات لضمان تبوغ كافية لصغيرة الحجم شكل multiwell. Sporulating في شكل 96 لوحة multiwell يسمح للخلايا ليتم عرضه باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية والكواشف الأمثل لشكل لوحة multiwell، مثل هذا الفحص لالمكثفات نسخة عالية باستخدام مكتبة مزينة بالبلاط 14-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكول للsporulating SK1 الخميرة في شكل multiwell 96. التهوية هي المفتاح للتبوغ كفاءة، الأمر الذي يتطلب استخدام إما بقضيب أو حبة الزجاج في كل بئر. عندما يتم sporulated الخلايا في لوحة multiwell 96 في حاضنة تهتز دون أي حبة أو بقضيب، الخلايا لا sporulate بكفاءة. وينظر فقط زيادة صغيرة في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة جوزيف هيلي من جامعة ماساتشوستس في بوسطن (LSH) وR15 GM86805 من المعاهد الوطنية للصحة (LSH). ويدعم SMP جزئيا على زمالة سانوفي-جنزايم في جامعة ماساتشوستس في بوسطن.
Materials
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. 유전학. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. 유전학. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker’s yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
