La esporulación eficiente de<em> Saccharomyces cerevisiae</em> En un formato de 96 multipocillos

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

La esporulación en la levadura en ciernes ha sido estudiado para proporcionar información sobre muchos aspectos de la biología, incluyendo el control de la segregación de cromosomas durante la meiosis ^1, los mecanismos de recombinación genética ^2, el control del desarrollo de células de señalización ^3, control nutricional de desarrollo ^4, la transcripción regulación del desarrollo ^5, y el examen de la formación de esporas ^6. La formación de esporas incluye una novela caso la división celular que implica la formación de nuevos compartimentos de membrana dentro de la célula madre seguido de la deposición de una pared de la espora de protección ^6. Estos estudios que examinan células esporuladas a menudo se aprovechan de la cepa de levadura rápida esporulación SK1, que puede someterse al proceso de esporulación en aproximadamente 24 hr de una manera relativamente eficiente ^7,8. Aunque optimización de las condiciones de esporulación de levadura en ciernes se han descrito ^9-13, estos experimentoss examinó la esporulación en medios sólidos o en cultivos líquidos de mayor escala, donde la esporulación se lleva a cabo utilizando tubos de cultivo o frascos.

Aquí se describe un método para la esporulación de levadura en un formato de placa de múltiples pocillos 96. Encontramos que para este método, la aireación es crítica para la esporulación síncrono y eficiente, y hemos ideado técnicas para asegurar la suficiente esporulación un formato de múltiples pocillos de pequeño volumen. Esporulación en un formato de 96 placa de múltiples pocillos permite para las células para ser examinadas usando técnicas de alto rendimiento optimizados y reactivos para un formato de placa de múltiples pocillos, como la detección de altos supresores de copias deseado con una biblioteca de azulejos ^14-16.

Protocol

1. Preparación para la esporulación Nota:. Los medios descritos en este protocolo se realizan utilizando las recetas y los métodos estándar 13,17 La tabla 1 muestra la formulación de 1 l de los diferentes medios utilizados en este protocolo. <td s…

Representative Results

Para evaluar este protocolo, las eficiencias de esporulación obtenidos de esporulación las células en placas de pocillos múltiples (como se describió anteriormente) se compararon a las células esporulados utilizando volúmenes más grandes en matraces (Tabla 2). El uso de placas de múltiples pocillos no alcanzó la alta eficiencia se ve cuando esporulación en frascos, donde la eficiencia ~ 80% se puede ver de forma rutinaria. Esporulación en placas de poci…

Discussion

Aquí se presenta un protocolo para la esporulación de levadura SK1 en un formato de múltiples pocillos 96. La aireación es clave para la esporulación eficiente, que requiere el uso de cualquiera de una barra de agitación o una perla de vidrio en cada pocillo. Cuando las células son esporulados en una placa de múltiples pocillos 96 en una incubadora de agitación sin ya sea un cordón o una barra de agitación, las células no esporulan eficiente. Sólo un pequeño aumento en la eficiencia de la esporulación se …

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4