효율적인 포자 형성<em> 사카로 마이 세스 세레 비지에</em> 96 멀티 웰 형식으로

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

신진 효모의 포자 형성은 감수 분열 ^(1), 유전자 재조합 ^2의 메커니즘 ⁽³⁾ 세포 신호에 의해 발전의 제어, 개발 ^4의 영양 관리, 전사시 염색체 분리의 제어를 포함 생물학의 여러 측면, 통찰력을 제공하기 위해 연구되고있다 개발 ^5의 규제 및 포자 형성 ^(6)의 시험. 포자 형성 보호 포자 벽 ^(6)의 증착에 이어 머더 셀 내의 새로운 멤브레인 구획의 형성을 포함하는 신규 한 세포 분열 이벤트를 포함한다. 포자 세포 검사 이러한 연구들은 상대적으로 효율적인 방식으로 ^7,8- 약 24 시간에 포자 형성 과정을 거칠 수있는 급속 포자 효모 SK1, 활용. 효모 신진 포자 조건의 최적화는 ^9-13,이 실험 설명되었지만S는 고체 배지 또는 포자를 배양 튜브 또는 플라스크를 사용하여 수행되는 대규모의 액체 배양 물에서 포자를 조사 하였다.

여기에서 우리는 96 멀티 웰 플레이트 형식으로 효모 포자하는 방법을 설명합니다. 우리는이 방법에 대해, 통기 동기와 효율적인 포자 형성에 중요한 것을 발견하고, 작은 볼륨 멀티 웰 형식으로 충분한 포자 형성을 보장하기 위해 기술을 고안했다. 세포는 높은 처리량 기술과 바둑판 라이브러리 ^14-16을 사용하여 높은 카피 억제하는 멀티 웰 플레이트 형식 그러한 스크리닝에 최적화 된 시약을 사용하여 스크리닝 될 수 있도록 96- 멀티 웰 플레이트 형식으로 포자 것은 허용한다.

Protocol

1. 포자 형성을위한 준비 참고 :.이 프로토콜에 설명 된 미디어는 표준 조리법과 방법을 사용하여 제조하는 13, 17 표 1은이 프로토콜에서 사용되는 다양한 미디어의 1 L에 대한 제제를 제공합니다. …

Representative Results

이 프로토콜을 평가하기 위해, (전술 한 바와 같이) 멀티 웰 플레이트에서 세포를 포자로부터 얻어진 포자 효율은 형틀 (표 2)에 큰 볼륨을 사용 포자 세포를 비교 하였다. 멀티 웰 플레이트의 사용은 ~ 8​​0 %의 효율은 통상적으로 볼 수있는 플라스크에 포자 볼 때 높은 효율을 달성하지 않았다. (유리 비드 또는 교반 막대로 제공됨) 적합한 통기 멀티 웰 ?…

Discussion

여기에서 우리는 96 멀티 웰 형식으로 SK1 효모를 포자를위한 프로토콜을 제시한다. 폭기는 교반 막대 또는 아니라 각각의 유리 구슬 중 하나의 사용을 필요로 효율적인 포자 형성을위한 열쇠입니다. 세포가 비드 또는 교반 막대 하나없이 진탕 배양기에서 96 멀티 웰 플레이트에 포자 경우, 세포가 효율적으로 sporulate하지 않습니다. 세포가 비드 또는 (교반없이 30 ° C에서 표 1 인에 비해…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4