Effiziente Sporulation von<em> Saccharomyces cerevisiae</em> In einer 96-Multiwell-Format

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

Sporulation in der Bäckerhefe wurde untersucht , Einblicke in viele Aspekte der Biologie zu schaffen, einschließlich der Kontrolle der Chromosomensegregation während der Meiose ^1, Mechanismen der genetischen Rekombination ^2, die Kontrolle der Entwicklung von Zelle ³ Signalisierung, Ernährungs – Management von Entwicklung ^4, die Transkriptions Regulierung der Entwicklung ⁵ und die Prüfung der Sporenbildung ^6. Sporenbildung beinhaltet eine neuartige Zellteilung Ereignis die Bildung neuer Membran Kompartimente innerhalb der Mutterzelle durch Abscheiden einer Schutzsporenwand ⁶ gefolgt beteiligt sind . Diese Studien , die sporulierendem Zellen oft nutzen die schnell sporulierendem Hefestamm SK1 zu untersuchen, die den Prozess der Sporulation in etwa 24 Stunden in einem relativ effiziente Art und Weise ^7,8 eingehen können. Obwohl die Optimierung der Sporulationsbedingungen für Hefe – Knospung haben ^9-13 beschrieben worden ist , diese Experiments geprüft Sporulation auf festen Medien oder in größerem Maßstab flüssige Kulturen, in denen die Sporenbildung durchgeführt wird Kulturröhrchen oder Kolben verwendet wird.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur sporulierenden Hefe in einem 96-Multiwell-Platten-Format. Wir finden, dass für dieses Verfahren, Belüftung für synchrone und effiziente Sporulation kritisch ist, und haben Techniken entwickelt, um eine ausreichende Sporulation ein kleinvolumiger Multiwell-Format zu gewährleisten. In einer 96 Multi – Well – Plattenformat sporulierendem ermöglicht Zellen für eine Multi – Well – Plattenformat, wie zum Screening für eine hohe Kopien Suppressoren mit einem gekachelten Bibliothek ^14-16 optimierte Hochdurchsatztechniken und unter Verwendung von Reagenzien zu sehen sein.

Protocol

1. Vorbereitung für Sporulation . Anmerkung: Die Medien in diesem Protokoll beschrieben werden , hergestellt unter Verwendung Standardrezepturen und -verfahren 13,17 Tabelle 1 gibt die Formulierung für 1 L der verschiedenen Medien in diesem Protokoll verwendet. <td height="15" style="height:…

Representative Results

Um dieses Protokoll Beurteilung Sporulation Effizienzen aus sporulierenden Zellen in Multi – Well – Platten erhalten (wie oben beschrieben) wurden im Vergleich zu Zellen sporuliert Verwendung größerer Volumen in den Flaschen (Tabelle 2). Die Verwendung von Multiwell-Platten nicht erreicht die hohe Effizienz gesehen, wenn in Flaschen sporulierenden, wobei ~ 80% Wirkungsgrad routinemäßig gesehen werden kann. Sporulierendem in Mikrotiterplatten mit der richtigen B…

Discussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll für sporulierendem SK1 Hefe in einem 96 Multi-Well-Format. Belüftung ist der Schlüssel für die effiziente Sporulation, die die Verwendung von entweder einem Rührstab oder einer Glasperle in jeder Vertiefung erfordert. Wenn Zellen ohne entweder in einer 96-Mikrotiterplatte in einem Schüttelinkubator sporulierten sind eine Perle oder einem Rührstab, Sporulation nicht effizient Zellen. Nur ein geringer Anstieg der Sporulationseffizienz gesehen wird , wenn Zellen ohne entweder ein…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4