Sporulation efficace de<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Dans un 96 Multiwell Format

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose ^1, les mécanismes de recombinaison génétique ^2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation ^3, contrôle nutritionnel du développement ^4, la transcription régulation du développement ^5, et l'examen de la formation de spores ^6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l' intérieur de la membrane de la cellule mère , suivie par le dépôt d'une paroi protectrice ⁶ spores. Ces études qui examinent les cellules sporulantes profitent souvent de la souche de levure sporulation rapidement SK1, qui peut subir le processus de sporulation dans environ 24 heures de façon relativement efficace ^7,8. Bien que l' optimisation des conditions de sporulation de la levure bourgeonnante ont été décrits ^13/09, ces expériencess examiné sporulation sur des supports solides ou dans les grandes cultures liquides à grande échelle où sporulation est effectuée en utilisant des tubes de culture ou flacons.

Nous décrivons ici un procédé pour la sporulation de la levure dans un format de plaque multipuits 96. Nous constatons que, pour ce procédé, l'aération est essentielle pour la sporulation synchrone et efficace, et ont mis au point des techniques pour assurer une sporulation suffisante d'un format multi-puits de faible volume. Sporuler dans un format de plaque multipuits 96 permet de cellules devant être criblés en utilisant des techniques à haut débit et des réactifs optimisés pour un format de plaque multipuits, un tel criblage pour des suppresseurs de copies élevé en utilisant une bibliothèque de tuiles ^14-16.

Protocol

1. Préparation de sporulation Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard 13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole. <…

Representative Results

Pour évaluer ce protocole, l' efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci – dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L'utilisation de plaques multipuits n'a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d'efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation…

Discussion

Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l'utilisation soit d'un barreau d'agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d'agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l'efficacité de la sporulation es…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4