Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
נביגה ב השמרים ניצני נחקרה לספק תובנות היבטים רבים של הביולוגיה, כולל שליטה על הפרדה כרומוזום במהלך המיוזה 1, מנגנוני שחלוף 2, שליטה של פיתוח על ידי התא איתות 3, שליטה התזונתי של פיתוח 4, תעתיק הסדרת פיתוח 5, ובחינת יצירת הנבגים 6. יצירת נבגים כוללת אירוע חלוקת תא רומן מעורב ההיווצרות של תאי קרום חדשים בתוך תא אמא ואחריו בתצהיר של קיר נבג מגן 6. מחקרים אלה הבוחנים תאים sporulating מנצלים לעתים קרובות זן שמרים sporulating במהירות sK1, אשר יכול לעבור תהליך של נביגה בערך 24 שעות בצורה יעילה יחסית 7,8. למרות אופטימיזציה של תנאי נביגה בשביל נבגי שמרים תוארו 9-13, אלה לביצוע הניסויs בחן נביגה על התקשורת מוצק או נוזלי בתרבויות בקנה מידה גדול יותר שבו נביגה מתבצעת באמצעות צינורות תרבות או צלוחיות.
כאן אנו מתארים שיטה sporulating שמרים במתכונת צלחת multiwell 96. אנו מוצאים כי בשיטה זו, אוורור הוא קריטי עבור נביגה סינכרוני ויעיל, פיתחו טכניקות כדי להבטיח נביגה מספיק בפורמט multiwell קטן-נפח. Sporulating במתכונת צלחת multiwell 96 מאפשר לתאים להיות מוקרנים באמצעות טכניקות תפוקה גבוהה ריאגנטים מותאם במיוחד בפורמט צלחת multiwell, הקרנה כזה מדכאי גבוהה עותק באמצעות ספריית רעפים 14-16.
כאן אנו מציגים פרוטוקול sporulating שמרים sK1 במתכונת multiwell 96. אוורור הוא מפתח עבור נביגה יעילה, אשר מחייבת שימוש או בר ומערבב או חרוז זכוכית בכל טוב. כאשר תאים התנבג בצלחת multiwell 96 בתוך חממה רועדת בלי שאחד חרוז או ומערבבים ברים, תאים אינם sporulate ביעילות. רק עלייה קטנה יעילות נבי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ג'וזף פ הילי מאוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון (LSH) ו R15 GM86805 מ- NIH (LSH). SMP הוא נתמך בחלקו על ידי עמיתי Sanofi-ג'נזיים באוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |