の効率的な胞子形成<em>サッカロマイセス・セレビシエ</em> 96マルチウェルフォーマットで

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

出芽酵母における胞子形成が減数分裂^1、遺伝子組換え²のメカニズム^{、3シグナル}伝達細胞による開発のコントロール、開発⁴の栄養制御、転写時の染色体分離の制御を含む生物学の多くの側面、洞察を提供することが検討されています開発⁵の規制、および胞子形成⁶の検討。胞子形成は、保護胞子壁⁶の堆積に続いて母細胞内の新しい膜区画の形成を含む新規な細胞分裂事象を含みます。胞子形成細胞を調べるこれらの研究は、多くの場合、比較的効率的なやり方^7,8で約24時間で胞子形成のプロセスを経ることができる急速に胞子形成酵母株SK1、を利用します。出芽酵母のための胞子形成条件の最適化は^、9月13日 、これらの実験について説明したがSは、固体培地上または胞子形成は、培養チューブもしくはフラスコを用いて行われる大規模な液体培養物中で胞子形成を調べました。

ここでは、96マルチウェルプレートフォーマットで酵母を胞子形成するための方法を説明します。我々は、この方法のために、通気が同期および効率的な胞子形成のために重要であることを見つけると、小容量マルチウェルフォーマット十分な胞子形成を確保するための手法を考案しました。細胞は、高スループット技術とタイルライブラリ^14-16を使用して高コピー抑制のためのマルチウェルプレートフォーマット、このようなスクリーニングのために最適化された試薬を用いてスクリーニングされる96マルチウェルプレート形式で胞子形成することができます。

Protocol

1.胞子形成のための準備注：このプロトコルに記載されたメディアは、標準的なレシピと方法13,17を用いて製造される。表1は 、このプロトコルで使用される様々なメディアの1 Lのための製剤が得られます。 <td height="15" st…

Representative Results

（上記のように）このプロトコールを評価するために、胞子形成効率は、マルチウェルプレート中で胞子形成細胞から得られたフラスコ（ 表2）に大きなボリュームを使用して胞子形成細胞と比較しました。マルチウェルプレートの使用は〜80％の効率が日常的に見ることができるフラスコに胞子形成時に見られる高効率を達成しませんでした。 （?…

Discussion

ここでは、96マルチウェルフォーマットでSK1酵母を胞子形成するためのプロトコルを提示します。エアレーションは、各ウェル中の攪拌棒やガラスビーズのいずれかの使用を必要とする、効率的な胞子形成するためのキーです。細胞は、ビーズや撹拌棒のいずれかなし振盪インキュベーター中で96マルチウェルプレートに胞子形成されている場合、細胞が効率的に胞子を形成しません。細胞は…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4