Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
Sporulering i det spirende gjær har blitt studert for å gi innsikt i mange aspekter av biologi, herunder kontroll av kromosom segregering under meiose 1, mekanismer for rekombinasjon 2, kontroll av utviklingen av cellesignalisering 3, ernæringsmessige kontroll av utviklingen 4, den transkripsjonelle regulering av utvikling 5, og undersøkelse av sporedannelse 6. Sporedannelse omfatter en ny celledeling hendelse som medfører dannelse av nye membran oppbevaringsrom innenfor modercellen, fulgt av avsetning av et beskyttende sporevegg 6. Disse studiene som undersøker sporedannende celler ofte dra nytte av den raskt sporedannende gjærstamme SK1, som kan gjennomgå prosessen med sporulation i ca 24 timer på en relativt effektiv måte 7,8. Selv om optimalisering av sporulation vilkår for spirende gjær har blitt beskrevet 9-13, disse eksperiments kontrollert sporedannelsen på fast medium eller i større skala flytende kulturer der sporedannelsen utføres ved anvendelse av kultur rør eller kolber.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for sporedannende gjær i en 96 flerbrønn plateformat. Vi finner at for denne metoden, er kritisk for synkron og effektiv sporulering lufting, og har utviklet teknikker for å sikre tilstrekkelig sporulering et lite volum for flere brønner format. Sporedannende i en 96 multiwell plate format gjør det mulig for cellene å bli vist ved hjelp av high-throughput teknikker og reagenser som er optimalisert for en multiwell plate format, slik screening for høye kopidempere ved hjelp av en flislagt bibliotek 14-16.
Her presenterer vi en protokoll for sporedannende SK1 gjær i en 96 multiwell format. Lufting er viktig for effektiv sporulation, som krever bruk av enten en rørepinne eller et glass perle i hver brønn. Når cellene er sporulerte i en 96 flerbrønn plate i en risteinkubator uten enten en vulst eller en rørestav, gjør cellene ikke sporulere effektivt. Bare en liten økning i sporulering effektivitet blir sett når cellene sporulerte uten enten en vulst eller en rørestav i en risteinkubator, forhold til å være ved …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Joseph P. Healey stipend fra University of Massachusetts Boston (LSH) og R15 GM86805 fra NIH (LSH). SMP støttes delvis av en Sanofi-Genzyme Fellowship ved University of Massachusetts Boston.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |