Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
Спороношение в почкующихся дрожжей было изучено , чтобы дать представление о многих аспектах биологии, в том числе контроль сегрегации хромосом во время мейоза 1, механизмы генетической рекомбинации 2, контроль развития клеткой сигнализации 3, питательная контроль развития 4, транскрипционный регулирование развития 5, а также рассмотрение спорообразования 6. Спорообразование включает новое событие деление клеток , предусматривающий создание новых мембранных отсеков внутри материнской клетки с последующим нанесением защитного споровой стенки 6. Эти исследования , которые исследуют спорообразующих клеток часто используют быстро спорообразующих штамма дрожжей SK1, который может пройти процесс спорообразования примерно 24 ч в относительно эффективным способом 7,8. Хотя оптимизация условий спорообразования для почкующихся дрожжей были описаны 9-13, это экспериментs исследовали споруляции на твердой среде или в более крупных жидких культурах, где споруляция осуществляется с использованием культуры трубок или колб.
Здесь мы опишем метод спорообразующих дрожжей в многоямного формате пластины 96. Мы считаем, что для этого метода, аэрация имеет решающее значение для синхронного и эффективного споруляции, и разработали методы, чтобы обеспечить достаточное количество споруляцию малого объема многоямный формат. Спорообразующих в формате 96 многоямный пластины позволяет клеткам быть подвергнуты скринингу с использованием методов с высокой пропускной способностью и реагенты , оптимизированные для многоямного формата пластины, такой скрининг для высоких супрессоров копирования с использованием черепичную библиотеки 14-16.
Здесь мы приводим протокол для спорообразующих SK1 дрожжей в 96 многоямного формате. Аэрация является ключевым фактором для эффективной споруляции, что требует использования либо мешалкой или стеклянного шарика в каждую лунку. Когда клетки спорообразования в 96 многоямного пластины в ш?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Джозеф П. Хили из Университета штата Массачусетс Бостон (LSH) и R15 GM86805 из NIH (LSH). SMP поддерживается частично посредством Sanofi-Genzyme стипендий в Университете штата Массачусетс в Бостоне.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |