Tests voor de bestudering van de rol van Vitronectin in bacteriële hechting en een Serum
Summary
Dit verslag beschrijft protocollen voor het karakteriseren van interacties tussen bacteriële buitenmembraan proteïnen en de menselijke aanvulling regelgever vitronectin. De protocollen kunnen worden gebruikt om de bindende reacties en biologische functie van vitronectin in elke bacteriesoorten te studeren.
Abstract
Aanvulling regelgevers bacteriën gebruiken als een middel om de immuunrespons van de gastheer te ontduiken. We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de overname van de vitronectin rol in de bacteriële cel oppervlakte speelt in verzet tegen het immuunsysteem van de gastheer. Stroom cytometry experimenten geïdentificeerd menselijk plasma vitronectin als ligand voor de bacteriële receptor buitenmembraan proteïne H van Haemophilus influenzae type f. Een enzym-verbonden immunosorbent analyse te karakteriseren van de eiwit-eiwit interacties tussen gezuiverde recombinante eiwitten H en vitronectin werkzaam was, en bindende affiniteit werd beoordeeld met behulp van bio-laag interferometrie. Het biologische belang van de binding van vitronectin aan proteïne H aan het oppervlak van de bacteriële cel in ontduiking van de immuunrespons van de gastheer werd bevestigd met behulp van een bepaling van de weerstand serum met normale en vitronectin-verarmd menselijk serum. Het belang van vitronectin in de naleving van de bacteriële werd geanalyseerd via glas dia’s met en zonder vitronectin coating, gevolgd door de Gram-kleuring. Ten slotte, bacteriële hechting op menselijke alveolaire epitheliale cel monolayers werd onderzocht. De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk aangepast worden aan de studie van eventuele bacteriële soorten van belang.
Introduction
Vitronectin (Vn) is een belangrijke menselijke glycoproteïne die betrokken zijn bij het handhaven van de homeostase via regulering van het fibrinolytic systeem. VN functioneert ook als een regulator aanvulling door remming van de terminal complement pathway tijdens de complexvorming C5b6-7 en C9 polymerisatie. Verschillende bacteriële pathogenen hebben aangetoond dat het werven van de Vn aan het celoppervlak als een middel voor verzet tegen aanvulling afzetting1,2,3. Bovendien functioneert Vn als een “sandwich”-molecuul tussen bacteriën en host epitheliale cel receptoren, aldus bevordering van naleving en internalisering van ziekteverwekkers2,4,5. Binding van de Vn aan de oppervlakte van de bacteriële cel wordt gemedieerd door andere momenteel onbekend eiwitten. Volledig het ophelderen van de functionele rol van Vn-binding in ontduiking van de immuunrespons van de slang zal daarom identificatiegegevens van Vn-werven eiwitten nodig.
De eerste stap bij het identificeren van de Vn-bindende proteïnen is om te testen of een ziekteverwekker van belang gezuiverde Vn. stroom cytometry binden kunt is een handige en eenvoudige methode om te bepalen of de Vn is gebonden aan pathogen cellen. In deze studie beoordelen we de binding van de Vn aan verschillende Haemophilus influenzae type f (Hif) klinische isolaten6. De hier beschreven methode is kwantitatieve en kan worden gebruikt om te onderscheiden van de bindingscapaciteit van een breed scala van bacteriestammen. In een eerdere studie, we eiwit H (PH) van Hif gekenmerkt als een Vn-bindende eiwit7. Daarom, in de huidige studie, het Vn-bindende potentieel van wild-type (WT) Hif en Hif M10Δlph mutanten werden vergeleken met behulp van de beschreven protocollen.
Zodra vaststaat dat een ziekteverwekker Vn bindt, is de tweede stap te karakteriseren de oppervlakte Proteoom teneinde potentiële Vn-bindende proteïnen. Een aantal verschillende benaderingen kan worden gebruikt voor dit doel8,9, maar deze methoden zijn niet in dit verslag beschreven. De methode die het meest geschikt voor de behandeling van eiwit-eiwitinteractie is te recombinantly express geselecteerde bacteriële oppervlakte-eiwitten in E. coli en te zuiveren door chromatografie van de affiniteit. We gebruiken hier, PH en de moleculaire interactie met de Vn ter illustratie van de methode. Interacties tussen recombinante PH en Vn werden gekenmerkt met behulp van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 en een onlangs ontwikkelde, label-vrije techniek die bekend staat als bio-laag interferometrie (BLI)10,11. Overwegende dat de ELISAs kan worden gebruikt ter bevestiging van eiwit-eiwitinteractie, biedt BLI gedetailleerde gegevens met betrekking tot de kinetische parameters voor de afzonderlijke interacties.
De functionele rol van de Vn in de naleving van de bacteriële studeren, kunnen twee verschillende tests worden gebruikt. De eerste bepaling hier beschreven is rechtstreekse meting van bacteriële naleving van Vn-gecoate glazen oppervlakken, terwijl de tweede test aanhankelijkheid aan het oppervlak van epitheliale cellen onderzoekt. Voor de eerste assay, glas dia’s waren bedekt met de Vn en de binding van WT of mutant Hif stammen werd beoordeeld door Gramkleuring en microscopie. Deze techniek onderscheidt gemakkelijk bacteriën op basis van het vermogen om te binden Vn12. Bacteriële hechting op zoogdiercellen werd vervolgens geanalyseerd door de toevoeging van de gekweekte bacteriën op een monolayer van type II alveolaire epitheliale cellen; bacteriële bijlage werd beoordeeld door het tellen van het aantal kolonie-vormende eenheden (CFUs). Zelfklevend en verinnerlijkte bacteriën kunnen worden onderscheiden in de aanwezigheid of afwezigheid van Vn4,13.
De rol van de acquisitie van de Vn in bacteriële serumresistentie werd geëvalueerd aan de hand van een serum doden assay (d.w.z., serum bactericide activiteit). Om de beoordeling van de omvang van de overname van de Vn in serumresistentie, werd de bactericide activiteit van Vn-verarmd serum (VDS) vergeleken met die van normale menselijk serum (NHS). De methode gebruikt gemakkelijk onderscheidt Vn-bindende versus niet-bindende bacteriën op basis van serumresistentie. Wij gebruikte deze methode om de rol van de Vn in de serumresistentie van verschillende bacteriële pathogenen4,12te bestuderen.
Tal van methoden zijn voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties gemeld. Hier beschrijven we een aantal protocollen die kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van eventuele pathogenen teneinde de rol van de Vn in de pathogenese. Wij testten deze protocollen met verschillende ziekteverwekkers, en Hif werd gekozen als een voorbeeld voor dit verslag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacteriële pathogenen Vn werven aan het celoppervlak en gebruik maken van deze aanvulling regulator om te voorkomen dat de afzetting van aanvulling factoren en de voltooiing van de membraan aanval complexe2. VN functioneert ook als een molecule van de brug tussen bacteriële oppervlakte-eiwitten en host cel oppervlakte receptoren, waardoor ziekteverwekkers te houden aan het oppervlak van epitheliale cellen en vervolgens bemiddelen internalisering. In deze studie beschrijven we protocollen die kun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Foundation van Anna en Edwin Berger, Lars Hierta, de O.E. en Edla Johansson Foundation, de Zweedse Medical Research Council (verlenen van nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), de Stichting tegen kanker aan de Universiteit Ziekenhuis in Malmö, de Physiographical maatschappij (Forssman van Stichting), en de Skåne County Council van onderzoek en ontwikkeling Foundation.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
