מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום
Summary
הדו ח מתאר פרוטוקולים עבור אפיון אינטראקציות בין חלבונים חיידקי הממברנה החיצונית vitronectin מווסת את המשלים אנושי. הפרוטוקולים ניתן ללמוד את איגוד תגובות והתפקוד הביולוגי של vitronectin של כל מין חיידקית.
Abstract
חיידקים לנצל המשלים הרגולטורים, כאמצעי התחמקות את התגובה החיסונית של המארח. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים להערכת הרכישה vitronectin תפקיד-ההצגות משטח של תא החיידק בהתנגדות מערכת החיסון של הפונדקאי. ניסויים cytometry זרימה מזוהות vitronectin לפלסמה אנושית ליגנד עבור החלבון הממברנה החיצונית קולטן חיידקי H של Haemophilus influenzae סוג f. וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent הועסק כדי לאפיין את אינטראקציות חלבון חלבון רקומביננטי מטוהרים H בין vitronectin, איגוד זיקה הוערכה באמצעות ביו-שכבה אינטרפרומטריה. החשיבות הביולוגית של הכריכה של vitronectin לחלבון H על פני תא החיידק תוך התחמקות של התגובה החיסונית מארח אושר שימוש assay ההתנגדות של סרום עם נורמלי, מדולדל vitronectin בנסיוב אדם. חשיבותה של vitronectin ב הדבקות חיידקים נותחו באמצעות שקופיות זכוכית עם או בלי ציפוי vitronectin, ואחריו צביעת גראם. לבסוף, חיידקי הדבקה על תאי אפיתל מכתשי אדם monolayers נחקר. הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן להתאים בקלות במחקר של כל המינים חיידקי של ריבית.
Introduction
Vitronectin (Vn) הוא גליקופרוטאין אנושי חשוב מעורב בשמירה על הומאוסטזיס באמצעות התקנה של מערכת fibrinolytic. Vn מתפקד גם כרגולטור המשלים על ידי עיכוב מסלול המשלים מסוף במהלך היווצרות מורכבות C5b6-7, C9 הפילמור. מספר פתוגנים חיידקיים הוכחו לגייס Vn אל פני השטח של התא, כאמצעי2,1,התצהיר המשלים התנגדות3. בנוסף, Vn מתפקד מולקולה “כריך” בין חיידקים, המארח תאים אפיתל רצפטורים, הדבקות ובכך קידום הפנמה של פתוגנים2,4,5. איגוד של Vn השטח תא החיידק מתווך על ידי לחלבונים אחרים לא מזוהה כיום. מלא שחקרתי את תפקיד פונקציונלי Vn-איגוד של התחמקות של התגובה החיסונית צינור של ולכן ידרוש זיהוי של חלבונים Vn-גיוס.
השלב הראשוני לזיהוי. Vn-מחייב חלבונים הוא כדי לבדוק אם. חיידק עניין באפשרותך לאגוד מטוהרים Vn-מיכשור היא שיטה נוחה וישירה כדי לקבוע אם Vn מאוגד לתאים הפתוגן. במחקר זה, אנחנו העריכו את הכריכה של Vn שונים Haemophilus influenzae סוג f (Hif) מבודד קליניים6. השיטה המתוארת כאן היא כמותית, והוא יכול לשמש כדי להבדיל את קיבולת איגוד של מגוון רחב של זני חיידקים. במחקר הקודם, אנחנו מאופיין חלבון H (PH) של Hif כמו חלבון מחייב Vn7. לפיכך, במחקר הנוכחי, הפוטנציאל Vn-איגוד של מוטציות (WT) Hif פראי-סוגlph Hif M10Δ הושוו באמצעות פרוטוקולים המתואר.
ברגע נקבע כי. חיידק נקשר Vn, השלב השני הוא לאפיין את פרוטאום השטח על מנת לזהות פוטנציאל Vn-מחייב חלבונים. מגוון רחב של גישות יכול לשמש למטרה זו,8,9, אך הללו לא שתוארו בדו ח זה. השיטה המתאימה ביותר לבחינת אינטראקציות חלבון-חלבון היא recombinantly אקספרס שנבחר פני שטח חלבונים חיידקי ב e. coli ולטהר מאת כרומטוגרפיית זיקה. כאן, אנו משתמשים PH ואינטראקציה המולקולרי שלה עם Vn כדי להמחיש את השיטה. אינטראקציות בין PH רקומביננטי Vn מאופיינים באמצעות מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)7 וטכניקה ללא תווית שפותחו לאחרונה המכונה ביו-שכבה אינטרפרומטריה (בלי)10,11. בעוד ELISAs יכול לשמש כדי לאשר אינטראקציות חלבון-חלבון, רבנות בלי מספק נתונים מפורטים לגבי הפרמטרים קינטי של האינטראקציות.
ללמוד את תפקיד פונקציונלי Vn הדבקות חיידקים, שני מבחני שונים יכול להיות מנוצל. הבדיקה הראשונה המתוארת כאן היא מדידה ישירה של חיידקי ההקפדה משטחי זכוכית מצופים Vn, בעוד וזמינותו השני בוחן את הדבקות על פני השטח של תאים אפיתל. הבדיקה הראשונה, שקופיות זכוכית היו מצופים Vn, הכריכה של WT או מוטציה Hif זנים הוערכה על ידי גראם מיקרוסקופ. טכניקה זו מבדיל בקלות חיידקים מבוססת על היכולת לאגד Vn12. הידבקות חיידקים בתרבית של תאים ואז נותחו על ידי הוספת חיידקים בתרבית על גבי טפט של סוג II מכתשי תאים אפיתל; מצורף חיידקי הוערכה על ידי ספירת מספר המושבה יוצרי יחידות (CFUs). חיידקים מודבקת למביטה יכול להיות מכובד ב נוכחות או היעדרות של Vn4,13.
התפקיד של רכישת Vn בהתנגדות סרום חיידקי הוערך באמצעות הרג סרום assay (כלומר, פעילות אחרים סרום). כדי להעריך את המשמעות של רכישת Vn בהתנגדות סרום, פעילות אחרים של סרום מדולדל Vn (VDS) נמשל עם זה של נסיוב אדם נורמלי (NHS). השיטה המשמשת ברצון מבדיל Vn-איגוד נגד חיידקים מחייב מבוסס על התנגדות סרום. השתמשנו בשיטה זו כדי ללמוד את התפקיד של Vn במחתרת סרום של פתוגנים חיידקיים מספר4,12.
שיטות רבות דווחו ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים של ניתן להתאים בקלות במחקר של כל פתוגן כדי להעריך את התפקיד של Vn ב פתוגנזה. בדקנו פרוטוקולים אלה באמצעות פתוגנים שונים ולאחר Hif נבחר כדוגמה עבור דוח זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פתוגנים חיידקיים לגייס Vn השטח תא ולנצל את הרגולטור המשלים כדי למנוע התצהיר המשלים גורמים והשלמה של קרום התקפה מורכבים2. Vn משמשת גם כחברת מולקולה גשר בין חלבונים חיידקי משטח קולטני פני השטח של התא המארח, ובכך מאפשר פתוגנים לדבוק פני השטח של תאי אפיתל, לאחר מכן לתווך הפנמה. במחקר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן של אנה אדווין ברגר, לארס Hierta, רוצה שתיכנס לשם ואת Edla יוהנסון קרן, המועצה למחקר רפואי שוודי (להעניק מספר K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), קרן סרטן באוניברסיטה חולים במאלמו, החברה Physiographical (קרן של Forssman), ולא של מועצת המחוז סקונה ומחקר ופיתוח.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
