Summary

Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

Published: October 16, 2018
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Summary

Este relatório descreve protocolos para caracterizar as interações entre proteínas de membrana externa bacteriana e a vitronectina regulador do complemento humano. Os protocolos podem ser usados para estudar as reacções de vinculação e função biológica da vitronectina em qualquer espécie bacteriana.

Abstract

As bactérias utilizam reguladores de complemento como um meio de evasão da resposta imune do hospedeiro. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar a aquisição de vitronectina papel em peças de superfície da célula bacteriana em resistência para o sistema imunológico do hospedeiro. Experimentos de citometria de fluxo identificaram vitronectina plasma humano como um ligante para a proteína de membrana externa bacteriana do receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Um ensaio enzima-lig da imunoabsorção foi empregado para caracterizar as interações da proteína-proteína entre proteína recombinante purificada H e vitronectina, e vinculação afinidade foi avaliada usando interferometria de bio-camada. A importância biológica da vinculação da vitronectina a proteína H na superfície da célula bacteriana em evasão da resposta imune do hospedeiro foi confirmada usando um ensaio de resistência de soro com soro humano normal e vitronectina empobrecido. A importância da vitronectina na adesão bacteriana foi analisada usando lâminas de vidro com e sem revestimento vitronectina, seguido de coloração de Gram. Finalmente, a adesão bacteriana em monocamadas de células epiteliais alveolares humana foi investigada. Os protocolos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para o estudo de todas as espécies bacterianas de interesse.

Introduction

Vitronectina (Vn) é uma importante glicoproteína humana envolvido na manutenção da homeostase através de regulamentação do sistema fibrinolítico. Vn também funciona como um regulador de complemento inibindo o caminho de complemento terminal durante a formação do complexo C5b6-7 e polimerização C9. Vários patógenos bacterianos foram mostrados para recrutar Vn à superfície da célula, como um meio de resistir ao complemento deposição1,2,3. Além disso, Vn funciona como uma molécula de “sanduíche” entre bactérias e receptores de células epiteliais anfitrião, assim, promover a adesão e interiorização de patógenos2,4,5. Vinculação de Vn à superfície da célula bacteriana é mediada por outras proteínas atualmente não identificadas. Totalmente elucidar o papel funcional de Vn-ligação na evasão da resposta imune mangueira, portanto, exigirá a identificação das proteínas Vn-recrutamento.

O passo inicial na identificação de proteínas Vn é testar se um patógeno de interesse pode vincular purificada Vn. fluxo cytometry é um método conveniente e simples para determinar se o Vn é vinculado às células do patógeno. Neste estudo, avaliamos a ligação do Vn a vários Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolados clínicos6. O método descrito neste documento é quantitativo e pode ser usado para distinguir a capacidade de ligação de uma grande variedade de estirpes de bactérias. Em um estudo anterior, caracteriza-se proteína H (PH) de Hif como um Vn-ligação proteína7. Portanto, no presente estudo, o potencial de Vn-vinculação de mutantes de tipo selvagem (WT) Hif e Hif M10Δlph foram comparados usando os protocolos descritos.

Assim que for determinado que um patógeno vincula Vn, o segundo passo é caracterizar o proteome superfície a fim de identificar potenciais Vn-proteínas. Uma variedade de abordagens pode ser usada para este propósito8,9, mas essas metodologias não são descritas neste relatório. O método mais apropriado para examinar interações da proteína-proteína é recombinantes expressam proteínas de superfície bacterianas selecionadas em e. coli e purificar por cromatografia de afinidade. Aqui, nós usamos o PH e sua interação molecular com Vn para ilustrar o método. Interações entre recombinante PH e Vn foram caracterizadas usando uma enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)7 e uma técnica livre de etiqueta desenvolvida recentemente conhecido como bio-camada interferometria (BLI)10,11. Considerando que o Elisa pode ser usada para confirmar as interações da proteína-proteína, BLI fornece dados detalhados sobre os parâmetros cinéticos das interações.

Para estudar o papel funcional de Vn na adesão bacteriana, podem ser utilizados dois ensaios diferentes. O primeiro ensaio descrito aqui é uma medição direta de aderência bacteriana Vn-revestido em superfícies de vidro, Considerando que o segundo ensaio examina aderência à superfície das células epiteliais. Para o primeiro ensaio, lâminas de vidro foram revestidas com Vn, e a ligação do WT ou estirpes mutantes de Hif foi avaliada pela coloração de Gram e microscopia. Esta técnica distingue prontamente bactérias baseadas na capacidade para vincular Vn12. Aderência bacteriana às células dos mamíferos foi então analisada pela adição de bactérias cultivadas em uma monocamada de células alveolares tipo II; fixação bacteriana foi avaliada pela contagem do número de formadoras unidades (CFUs). Bactérias aderidas e interiorizadas podem ser distinguidas na presença ou ausência de Vn4,13.

O papel da aquisição de Vn em resistência bacteriana soro foi avaliado usando um ensaio de matança de soro (ou seja, atividade bactericida do soro). Para avaliar a importância da aquisição de Vn na resistência do soro, a atividade bactericida do soro Vn-esgotada (VDS) foi comparada com o de soro humano normal (NHS). O método usado prontamente distingue Vn-ligação contra bactérias não-vinculativa com base na resistência do soro. Nós usamos este método para estudar o papel do Vn da resistência de soro de vários patógenos bacterianos4,12.

Inúmeros métodos têm sido relatados para estudar interações patógeno-hospedeiro. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos que pode facilmente ser adaptado para o estudo de qualquer agente patogénico a fim de avaliar o papel de Vn na patogênese. Nós testamos estes protocolos utilizando vários patógenos e Hif foi escolhido como um exemplo para este relatório.

Protocol

1. análise de Vn como um ligante de proteína de superfície bacteriana Deteção de Vn-ligação na superfície bacteriana usando citometria de fluxoNota: Em citometria de fluxo, costumávamos lado scatter e dispersão frente portão eventos positivos. Para examinar as interações com Vn, Hif clínico isolados (n = 10)7 foram selecionados juntamente com Escherichia coli BL21 (DE3) como um controle negativo (Figura 1A…

Representative Results

Vn-vinculação à superfície de bactérias foi determinada por citometria de fluxo. Hif todos os isolados clínicos testados neste estudo recrutou Vn à superfície da célula. Nenhuma interação de Vn com superfície celular foi observada para a tensão de controle negativo de e. coli (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, PH é uma major Vn-proteína na superfície das células de…

Discussion

Patógenos bacterianos recrutam Vn à superfície da célula e utilizam este regulador de complemento para impedir a deposição de factores do complemento e conclusão da membrana ataque complexo2. Vn também funciona como uma molécula de ponte entre proteínas de superfície bacterianas e receptores de superfície celular hospedeiro, permitindo assim a patógenos de aderir à superfície das células epiteliais e posteriormente mediar a internalização. Neste estudo, descrevemos os protocolos …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação de Anna e Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e Edla Johansson Foundation, o sueco Medical Research Council (conceder o número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), a Fundação de câncer da Universidade Hospital em Malmö, a sociedade Physiographical (Fundação do Forssman) e o Conselho de Condado de Skåne pesquisa e Fundação para o desenvolvimento.

Materials

1.5 mL thermomixter Eppendorf 5355 dry block heating and cooling shaker
5 mL polystyrene round-bottom tube  BD Falcon 60819-138 12 × 75 mm style
5% CO2 supplied incubator  Thermo Scientific  BBD6220
6 mL polystyrene round-bottom tube  VWR 89000-478 12 × 75 mm style with cap
24-well plates BD Falcon 08-772-1H Cell culture grade
30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Laboratory analysis grade
75 cm2 tissue culture flask BD Falcon BD353136 Vented
96 well black flat bottom plate Greiner Bio-One 655090 Tissue culture treated µClear black plates
A549 Cell Line human Sigma-Aldrich 86012804-1VL
Cell detachment enzyme (Accutase)  Sigma-Aldrich A6964-500ML Cell Culture Grade
AR2G sensors Pall Life Science 18-5095 Sensor to immobilized protein by amino coupling 
Acetone VWR 97064-786 Analysis grade
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A2058 Suitable for cell culture
Bibulous paper  VWR 28511-007
Bio-layer interferometer Pall Life Science FB-50258 Bilayer interferometry measuring equipment
Crystal violet solution Sigma-Aldrich HT90132-1L
C4BP (C4b binding protein) Complement Technology, Inc. A109 Bought as Frozen liquid form
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
Carbol-fuchsin solution Sigma-Aldrich HT8018-250ML
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500G American Chemical Society (ACS) grade
Decolorizing solution Sigma-Aldrich 75482-250ML-F
E. coli host (E. Coli BL21) Novagen 69450-3 Protein expression host
F12 medium Sigma-Aldrich D6421 Cell Culture Grade
Flow cytometer  BD Biosciences 651154 Cell analysis grade for research applications 
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich 12003C Suitable for cell culture
Normal human serum (NHS) Complement Technology, Inc. NHS Pooled human serum
FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies  AbD Serotec STAR88F Polyclonal
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Cell culture grade
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Suitable for cell culture
Hemocytometer Marienfeld 640210
HRP-conjugated anti-His tag antibodies Abcam ab1269 Polyclonal
Human factor H Complement Technology, Inc. A137 Bought as Frozen liquid form
C4BP Complement Technology, Inc. A109 Frozen solution
Human serum albumin Sigma-Aldrich A1653-10G lyophilized powder
Histidine affinity resin column (HisTrap HP) GE Health Care Life Science 17-5247-01 Columns prepacked with Ni Sepharose
His-tagged PH Recombinantly expressed and purified in our lab
Iodine solution Sigma-Aldrich HT902-8FOZ
Methanol VWR BDH1135-1LP Analysis grade
 Microscope Olympus IX73 Inverted microscope
Microscope slides Sigma-Aldrich S8902 plain, size 25 mm × 75 mm 
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-1KG
Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) Novagen 69862-3 DNA vector
Polysorb microtitre plates  Sigma-Aldrich M9410 For ELISA
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 6009 American Chemical Society (ACS) grade
Sheep anti-human Vn antibodies AbD Serotec AHP396 Polyclonal
Shaker  Stuart Scientific STR6 Platform shaker
Tissue culture flask BD Falcon 3175167 75 cm2
 Thermomixer  Sigma-Aldrich T3317 Dry block heating and cooling shaker
Tetramethylbenzidine Sigma-Aldrich 860336-100MG ELISA grade
Vitronectin (Vn) from human plasma Sigma-Aldrich V8379-50UG cell culture grade

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Cite This Article
Singh, B., Mostajeran, M., Su, Y., Al-Jubair, T., Riesbeck, K. Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (140), e54653, doi:10.3791/54653 (2018).

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