Summary

Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

Published: October 16, 2018
doi:

Summary

Questo rapporto descrive protocolli per caratterizzare le interazioni tra proteine della membrana esterna batterica e la vitronectina regolatore complemento umano. I protocolli possono essere utilizzati per studiare le reazioni di associazione e la funzione biologica di vitronectin in qualsiasi specie batteriche.

Abstract

I batteri utilizzare regolatori di complemento come mezzo per eludere la risposta immunitaria. Qui, descriviamo protocolli per valutare l’acquisizione di vitronectin ruolo presso i giochi di superficie delle cellule batteriche nella resistenza al sistema immunitario dell’ospite. Esperimenti di citometria a flusso identificato vitronectina plasmatica umana come un legante per la proteina della membrana esterna batterica del recettore H di Hemophilus influenzae tipo f. Un’analisi enzima-collegata dell’immunosorbente è stata impiegata per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra proteina ricombinante purificata H e vitronectina e affinità di legame è stata valutata mediante interferometria bio-strato. L’importanza biologica del legame di vitronectin alla proteina H alla superficie delle cellule batteriche di evasione della risposta immunitaria ospite è stata confermata usando un’analisi di resistenza di siero con siero umano normale e vitronectina-vuotati. L’importanza di vitronectin in aderenza batterica è stata analizzata utilizzando lastre di vetro con e senza rivestimento vitronectina, seguita dalla macchiatura di grammo. Infine, è stata studiata l’adesione batterica di monostrati di cellule epiteliali alveolari umane. I protocolli descritti qui possono essere facilmente adattati per lo studio di qualsiasi specie batteriche di interesse.

Introduction

Vitronectina (Vn) è una glicoproteina umana importante coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi via il regolamento del sistema fibrinolitico. VN funziona anche come un regolatore di complemento inibendo la via di complemento terminale durante la formazione del complesso C5b6-7 e polimerizzazione C9. Parecchi agenti patogeni batterici sono stati indicati per reclutare Vn alla superficie delle cellule come mezzo di resistenza complemento deposizione1,2,3. Inoltre, Vn funziona come una molecola di “sandwich” tra batteri e recettori delle cellule epiteliali di host, quindi promuovere l’aderenza e interiorizzazione dei patogeni2,4,5. Associazione di Vn alla superficie delle cellule batteriche è mediata da altre proteine attualmente non identificati. Completamente delucidare il ruolo funzionale di Vn-associazione di evasione della risposta immunitaria tubo richiederà pertanto l’identificazione di proteine Vn-recruiting.

Il primo passo nell’identificazione di proteine che legano il Vn è per verificare se un agente patogeno di interesse possibile associare purificata Vn. flusso cytometry è un metodo pratico e semplice per determinare se Vn è associato a patogeni e cellule. In questo studio, abbiamo valutato l’associazione di Vn da vari Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolati clinici6. Il metodo qui descritto è quantitativo e può essere utilizzato per distinguere la capacità di legame di una grande varietà di ceppi batterici. In uno studio precedente, abbiamo caratterizzato la proteina H (PH) di Hif come Vn-legante della proteina7. Di conseguenza, nello studio presente, il potenziale di Vn-associazione dei mutanti di wild type (WT) Hif e Hif M10Δlph sono stati confrontati usando i protocolli descritti.

Una volta che è stato stabilito che un agente patogeno lega Vn, il secondo passo è di caratterizzare il proteoma di superficie al fine di identificare potenziali proteine che legano il Vn. Una varietà di approcci può essere utilizzata per questo scopo8,9, ma queste metodologie non sono descritti in questo rapporto. Il metodo più adatto per l’esame di interazioni proteina-proteina è recombinantly esprimere proteine di superficie batteriche selezionate in e. coli e purificare dalla cromatografia di affinità. Qui, usiamo il PH e la sua interazione molecolare con Vn per illustrare il metodo. Interazioni tra ricombinante PH e Vn sono state caratterizzate utilizzando un enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) l’analisi7 e una tecnica sviluppata di recente privo di etichetta, conosciuta come bio-strato interferometria (BLI)10,11. Mentre Elisa può essere utilizzata per confermare le interazioni proteina-proteina, BLI fornisce dati dettagliati per quanto riguarda i parametri cinetici delle interazioni.

Per studiare il ruolo funzionale di Vn in aderenza batterica, possono essere utilizzati due diversi saggi. Il primo test qui descritto è la misura diretta di aderenza batterica sulle superfici di vetro rivestite con Vn, mentre il secondo saggio esamina l’aderenza alla superficie delle cellule epiteliali. Per il primo test, lastre di vetro sono stati rivestiti con Vn, e l’associazione di WT o ceppi mutanti di Hif è stata valutata da microscopia e colorazione di Gram. Questa tecnica si distingue facilmente batteri basati sulla capacità di associare Vn12. Adesione batterica alle cellule dei mammiferi è stato quindi analizzato aggiungendo batteri coltivati su un monostrato di cellule epiteliali alveolari di II tipo; allegato batterica è stata valutata contando il numero di formazione di colonie (CFUs) unità. Aderito e interiorizzati batteri possono essere distinti in presenza o assenza di Vn4,13.

Il ruolo di acquisizione Vn in resistenza batterica del siero è stato valutato usando un’analisi di uccisione del siero (cioè, l’attività battericida del siero). Per valutare l’importanza di Vn acquisizione nella resistenza del siero, l’attività battericida del siero Vn-vuotati (VDS) è stata confrontata con quella di siero umano normale (NHS). Il metodo utilizzato prontamente distingue Vn-associazione contro batteri vincolanti basati sulla resistenza del siero. Abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo di Vn nella resistenza del siero di diversi batteri patogeni4,12.

Sono stati segnalati numerosi metodi per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Qui, descriviamo una serie di protocolli che possono essere facilmente adattate per lo studio di qualsiasi agente patogeno al fine di valutare il ruolo di Vn nella patogenesi. Abbiamo testato questi protocolli usando vari agenti patogeni, e Hif è stato scelto come esempio per questo report.

Protocol

1. analisi di Vn come ligando della proteina della superficie batterica Rilevamento di Vn-associazione sulla superficie batterica mediante citometria a flussoNota: In citometria a flusso, abbiamo usato side scatter e forward scatter a cancello eventi positivi. Per esaminare le interazioni con Vn, gli isolati clinici di Hif (n = 10)7 sono stati selezionati insieme a e. coli BL21 (DE3) come controllo negativo (Figura 1A</…

Representative Results

VN-si legano alla superficie dei batteri è stato determinato tramite flusso cytometry. Tutti Hif isolati clinici testati in questo studio ha reclutato Vn alla superficie delle cellule. Alcuna interazione di Vn con superficie delle cellule è stata osservata per il ceppo di controllo negativo Escherichia coli (Figura 1A). Come illustrato nella Figura 1B, PH è una proteina legante il Vn …

Discussion

Batteri patogeni reclutano Vn alla superficie delle cellule e utilizzano questo regolatore di complemento per impedire la deposizione di fattori del complemento e completamento del complesso membrana attacco2. VN funziona anche come una molecola di ponte tra proteine di superficie batteriche e host recettori di superficie, consentendo in tal modo gli agenti patogeni di aderire alla superficie delle cellule epiteliali e successivamente mediare interiorizzazione. In questo studio, descriviamo i prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione di Anna ed Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e fondamento di Edla Johansson, svedese Medical Research Council (concedere numero K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondazione di cancro all’Università Ospedale a Malmö, della società fisiografica (di Forssman Foundation) e del Consiglio della Contea di Skåne Fondazione ricerca e sviluppo.

Materials

1.5 mL thermomixter Eppendorf 5355 dry block heating and cooling shaker
5 mL polystyrene round-bottom tube  BD Falcon 60819-138 12 × 75 mm style
5% CO2 supplied incubator  Thermo Scientific  BBD6220
6 mL polystyrene round-bottom tube  VWR 89000-478 12 × 75 mm style with cap
24-well plates BD Falcon 08-772-1H Cell culture grade
30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Laboratory analysis grade
75 cm2 tissue culture flask BD Falcon BD353136 Vented
96 well black flat bottom plate Greiner Bio-One 655090 Tissue culture treated µClear black plates
A549 Cell Line human Sigma-Aldrich 86012804-1VL
Cell detachment enzyme (Accutase)  Sigma-Aldrich A6964-500ML Cell Culture Grade
AR2G sensors Pall Life Science 18-5095 Sensor to immobilized protein by amino coupling 
Acetone VWR 97064-786 Analysis grade
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A2058 Suitable for cell culture
Bibulous paper  VWR 28511-007
Bio-layer interferometer Pall Life Science FB-50258 Bilayer interferometry measuring equipment
Crystal violet solution Sigma-Aldrich HT90132-1L
C4BP (C4b binding protein) Complement Technology, Inc. A109 Bought as Frozen liquid form
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
Carbol-fuchsin solution Sigma-Aldrich HT8018-250ML
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500G American Chemical Society (ACS) grade
Decolorizing solution Sigma-Aldrich 75482-250ML-F
E. coli host (E. Coli BL21) Novagen 69450-3 Protein expression host
F12 medium Sigma-Aldrich D6421 Cell Culture Grade
Flow cytometer  BD Biosciences 651154 Cell analysis grade for research applications 
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich 12003C Suitable for cell culture
Normal human serum (NHS) Complement Technology, Inc. NHS Pooled human serum
FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies  AbD Serotec STAR88F Polyclonal
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Cell culture grade
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Suitable for cell culture
Hemocytometer Marienfeld 640210
HRP-conjugated anti-His tag antibodies Abcam ab1269 Polyclonal
Human factor H Complement Technology, Inc. A137 Bought as Frozen liquid form
C4BP Complement Technology, Inc. A109 Frozen solution
Human serum albumin Sigma-Aldrich A1653-10G lyophilized powder
Histidine affinity resin column (HisTrap HP) GE Health Care Life Science 17-5247-01 Columns prepacked with Ni Sepharose
His-tagged PH Recombinantly expressed and purified in our lab
Iodine solution Sigma-Aldrich HT902-8FOZ
Methanol VWR BDH1135-1LP Analysis grade
 Microscope Olympus IX73 Inverted microscope
Microscope slides Sigma-Aldrich S8902 plain, size 25 mm × 75 mm 
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-1KG
Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) Novagen 69862-3 DNA vector
Polysorb microtitre plates  Sigma-Aldrich M9410 For ELISA
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 6009 American Chemical Society (ACS) grade
Sheep anti-human Vn antibodies AbD Serotec AHP396 Polyclonal
Shaker  Stuart Scientific STR6 Platform shaker
Tissue culture flask BD Falcon 3175167 75 cm2
 Thermomixer  Sigma-Aldrich T3317 Dry block heating and cooling shaker
Tetramethylbenzidine Sigma-Aldrich 860336-100MG ELISA grade
Vitronectin (Vn) from human plasma Sigma-Aldrich V8379-50UG cell culture grade

References

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

Play Video

Cite This Article
Singh, B., Mostajeran, M., Su, Y., Al-Jubair, T., Riesbeck, K. Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (140), e54653, doi:10.3791/54653 (2018).

View Video