فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل
Summary
ويصف هذا التقرير بروتوكولات لوصف التفاعلات بين البروتينات الغشاء الخارجي البكتيرية وفيترونيكتين منظم لتكملة البشرية. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة ردود فعل ملزم والوظيفة البيولوجية فيترونيكتين في أي من الأنواع البكتيرية.
Abstract
استخدام البكتيريا المنظمين تكملة كوسيلة للتهرب من الاستجابة المناعية المضيف. هنا، نحن وصف بروتوكولات لتقييم اكتساب دور فيترونيكتين في اللعب سطح الخلية البكتيرية في مقاومة المضيف الجهاز المناعي. التدفق الخلوي تجارب اعتبرت فيترونيكتين البلازما البشرية يجند للبروتين الغشاء الخارجي مستقبلات البكتيرية ح من النزلية من نوع f. كان يعمل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم لتوصيف البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتين المنقي المؤتلف ح وفيترونيكتين، وملزمة تقارب تم تقييم استخدام قياس التداخل بيو-طبقة. وأكد الأهمية البيولوجية لربط فيترونيكتين للبروتين ح على سطح الخلية البكتيرية في تهرب الاستجابة المناعية المضيف باستخدام مقايسة مقاومة مصل مع مصل الدم البشري الطبيعي والمنضب فيترونيكتين. وقد تم تحليل أهمية فيترونيكتين في التقيد البكتيرية باستخدام الشرائح الزجاجية مع أو بدون طلاء فيترونيكتين، متبوعاً بصبغة غرام. وأخيراً، كان التحقيق التصاق البكتيريا إلى مونولاييرس الخلايا الظهارية السنخية البشرية. البروتوكولات المذكورة هنا يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي الأنواع البكتيرية من الفائدة.
Introduction
فيترونيكتين (Vn) بروتين سكري بشرية هامة مشاركة في الحفاظ على التوازن عن طريق تنظيم النظام فيبرينوليتيك. Vn يعمل أيضا كمنظم تكملة عن طريق تثبيط في مسار تكملة المحطة الطرفية أثناء تكوين مجمع C5b6-7 والبلمره C9. أظهرت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية لتجنيد Vn إلى سطح الخلية كوسيلة لتكملة مقاومة ترسب1،2،3. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل Vn كجزيء “ساندويتش” بين البكتيريا والمضيف مستقبلات الخلايا الظهارية، وبالتالي تعزيز الالتزام واستيعاب العوامل الممرضة2،،من45. هو وساطة ملزمة Vn إلى سطح الخلية البكتيرية من البروتينات الأخرى مجهولة حاليا. توضيح دور وظيفي Vn-ملزمة في تهرب الاستجابة المناعية خرطوم الكامل سيتطلب تحديد البروتينات تجنيد Vn.
الخطوة الأولى في تحديد البروتينات Vn-ملزم اختبار ما إذا كان رض فائدة يمكن ربط المنقي Vn. التدفق الخلوي وسيلة مريحة وبسيطة لتحديد ما إذا كان Vn منضماً إلى خلايا الكائنات الممرضة. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم ربط Vn إلى مختلف النزلية من نوع f (منطقياً) يعزل السريرية6. الأسلوب الموصوفة هنا هو الكمية، ويمكن استخدامها للتمييز بين القدرة الملزمة لمجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية. في دراسة سابقة، ونحن تتميز البروتين ح (PH) منطقياً ك بروتين ملزمة Vn7. ولذلك، في هذه الدراسة، كانت مقارنة إمكانات Vn-الربط البرية من نوع (WT) منطقياً و M10Δ سكانية طفراتlph استخدام البروتوكولات وصف.
بمجرد ما تقرر أن يربط ممرض Vn، والخطوة الثانية لتوصيف البروتين السطحي بغية تحديد المحتملة Vn-ملزم البروتينات. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من النهج لهذا الغرض8،9، ولكن لم يرد وصف هذه المنهجيات في هذا التقرير. هو الأسلوب الأكثر ملاءمة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين للتعبير عن البروتينات السطحية البكتيرية المحدد في كولاي ريكومبينانتلي وتنقية بالتقارب اللوني. هنا، نحن نستخدم درجة الحموضة وتفاعله الجزيئية مع Vn لتوضيح الأسلوب. التفاعلات بين المؤتلف الأس الهيدروجيني و Vn اتسمت باستخدام المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)7 ووضعت مؤخرا خالية من تسمية تقنية تعرف باسم بيو-طبقة قياس التداخل (BLI)10،11. بينما يمكن استخدام الساس لتأكيد تفاعلات البروتين البروتين، BLI يوفر بيانات مفصلة فيما يتعلق بمعايير التفاعلات الحركية.
لدراسة دور وظيفي Vn في الانضمام البكتيرية، يمكن الاستفادة من فحوصات مختلفة اثنين. الفحص الأولى الموصوفة هنا هو القياس المباشر للبكتيريا التمسك الأسطح الزجاجية المغلفة Vn، حين المقايسة الثانية يدرس الانضمام إلى سطح الخلايا الظهارية. للفحص الأولى، كانت مغلفة بالشرائح الزجاجية مع Vn، وتم تقييم الربط WT أو متحولة منطقياً سلالات غرام-وصمة عار والفحص المجهري. ويميز هذا الأسلوب سهولة البكتيريا على أساس القدرة ربط Vn12. وقد تم تحليل التصاق البكتيريا لخلايا الثدييات ثم بإضافة البكتيريا المستزرعة على أحادي الطبقة من نوع الخلايا الظهارية السنخية الثاني؛ تم تقييم مرفق البكتيرية بإحصاء عدد تشكيل مستعمرة وحدات (كفوس). يمكن تمييزها في وجود أو عدم وجود4،Vn13البكتيريا المدخلة والتقيد بها.
تم تقييم دور اكتساب Vn في المقاومة البكتيرية المصل باستخدام مقايسة قتل مصل (أي، نشاط جراثيم المصل). لتقييم أهمية اكتساب Vn في المقاومة المصل، نشاط جراثيم المنضب Vn المصل (VDS) كان بالمقارنة بالمصل الإنسان العادي (NHS). الطريقة المستخدمة بسهولة يميز Vn-ملزم مقابل البكتيريا غير ملزمة استناداً إلى المقاومة المصل. لقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة دور Vn في المقاومة المصل لعدة مسببات الأمراض البكتيرية4،12.
وأبلغ أساليب عديدة لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات التي يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي مسببات المرض بغية تقييم دور Vn في الآلية المرضية. وقمنا باختبار هذه البروتوكولات باستخدام مسببات الأمراض المختلفة، واختير منطقياً كمثال لهذا التقرير.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعيين Vn إلى سطح الخلية مسببات الأمراض البكتيرية والاستفادة من هذا منظم مكملاً لمنع ترسب عوامل مكملة والانتهاء من غشاء معقدة هجوم2. Vn يعمل أيضا كجزيء جسر بين البروتينات السطحية البكتيرية ومستقبلات سطح الخلية المضيفة، مما مكن مسببات الأمراض التمسك بسطح الخلايا الظهارية والتو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أنا وبيرغر إدوين هيرتا لارس، O.E. ومؤسسة ادلا جوهانسون، “مجلس البحوث الطبية السويدية” (منح رقم K2015 57 س-03163-43-4، www.vr.se)، “مؤسسة مكافحة السرطان” في الجامعة مستشفى في مالمو الفيزيوغرافية المجتمع (فورسمان في المؤسسة)، ومجلس مقاطعة Skåne البحوث ومؤسسة التنمية.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
