बैक्टीरियल आसंजन और सीरम प्रतिरोध में Vitronectin की भूमिका का अध्ययन करने के लिए परख
Summary
इस रिपोर्ट में बैक्टीरिया बाहरी झिल्ली प्रोटीन और मानव पूरक नियामक vitronectin के बीच निस्र्पक बातचीत के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है । प्रोटोकॉल vitronectin के किसी भी जीवाणु प्रजातियों में बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं और जैविक समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
बैक्टीरिया मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने का एक साधन के रूप में पूरक नियामकों का उपयोग । यहां, हम जीवाणु कोशिका सतह पर भूमिका vitronectin अधिग्रहण के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के विरोध में खेलता है । प्रवाह cytometry प्रयोगों की पहचान मानव प्लाज्मा vitronectin के लिए एक ligand के रूप में बैक्टीरियल रिसेप्टर बाहरी झिल्ली प्रोटीन एच के Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार एफ एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख के लिए प्रोटीन-शुद्ध रिकॉमबिनेंट प्रोटीन एच और vitronectin, और बाध्यकारी अपनत्व के बीच प्रोटीन बातचीत विशेषताएं कार्यरत था जैव परत interferometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । प्रोटीन एच करने के लिए vitronectin की बाइंडिंग के जैविक महत्व बैक्टीरियल कोशिका सतह पर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के चोरी में की पुष्टि की थी सामांय और vitronectin-समाप्त मानव सीरम के साथ एक सीरम प्रतिरोध परख का उपयोग कर । बैक्टीरियल पालन में vitronectin के महत्व के साथ और vitronectin कोटिंग के बिना कांच स्लाइड का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था, चना धुंधला के बाद । अंत में, मानव वायुकोशीय उपकला कोशिका monolayers के लिए बैक्टीरियल आसंजन की जांच की थी. यहां वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से रुचि के किसी भी जीवाणु प्रजातियों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
Vitronectin (Vn) fibrinolytic प्रणाली के विनियमन के माध्यम homeostasis को बनाए रखने में शामिल एक महत्वपूर्ण मानव ग्लाइकोप्रोटीन है । Vn भी C5b6-7 परिसर गठन और C9 बहुलकीकरण के दौरान मार्ग पूरक टर्मिनल बाधा से एक पूरक नियामक के रूप में कार्य करता है. कई जीवाणु रोगजनकों के लिए Vn की भर्ती करने के लिए दिखाया गया है कोशिका की सतह के लिए विरोध का एक साधन के रूप में1,2,3पूरक । इसके अलावा, बैक्टीरिया और मेजबान उपकला कोशिका रिसेप्टर्स के बीच एक “सैंडविच” अणु के रूप में Vn कार्य करता है, जिससे पालन को बढ़ावा देने और रोगजनकों के internalization2,4,5. बैक्टीरियल कोशिका सतह के लिए Vn के बंधन अन्य वर्तमान में अज्ञात प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता है. पूरी तरह से Vn की कार्यात्मक भूमिका elucidating नली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अपवंचन में बाध्यकारी इसलिए Vn की पहचान-प्रोटीन की भर्ती की आवश्यकता होगी ।
Vn-बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान करने में प्रारंभिक कदम परीक्षण करने के लिए है कि क्या एक रोगज़नक़ के ब्याज शुद्ध Vn बांध कर सकते हैं । cytometry प्रवाह एक सुविधाजनक और सरल करने के लिए निर्धारित है कि क्या Vn रोगज़नक़ कोशिकाओं से बंधे है विधि है । इस अध्ययन में, हम विभिंन Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार एफ (Hif) नैदानिक6अलग करने के लिए Vn के बंधन का आकलन किया । यहां वर्णित विधि मात्रात्मक है और बैक्टीरिया उपभेदों की एक विस्तृत विविधता की बाध्यकारी क्षमता भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले एक अध्ययन में, हम एक Vn-बाध्यकारी प्रोटीन7के रूप में Hif के प्रोटीन एच (पीएच) की विशेषता । इसलिए वर्तमान अध्ययन में वाइल्ड-टाइप (WT) Hif और Hif M10Δ lph म्यूटेंट की Vn-बाइंडिंग क्षमता वर्णित प्रोटोकॉलों के उपयोग से तुलना की गई ।
एक बार यह निर्धारित किया जाता है कि एक रोगज़नक़ Vn बांधता है, दूसरे कदम के लिए सतह proteome की विशेषता है ताकि संभावित Vn बंधन प्रोटीन की पहचान । दृष्टिकोण की एक किस्म इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8,9, लेकिन इन तरीकों इस रिपोर्ट में वर्णित नहीं हैं । विधि प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए सबसे उपयुक्त recombinantly एक्सप्रेस चयनित बैक्टीरिया की सतह प्रोटीन ई. कोलाई में और अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध करने के लिए है । यहां, हम पीएच और Vn के साथ अपनी आणविक बातचीत का उपयोग करने के लिए विधि वर्णन । रिकॉमबिनेंट पीएच और Vn के बीच बातचीत एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)7 और एक हाल ही में विकसित लेबल मुक्त जैव परत interferometry (BLI)10,11के रूप में जाना जाता तकनीक का उपयोग विशेषता थे । जबकि एलिसा प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, BLI विस्तृत बातचीत के काइनेटिक मापदंडों के बारे में डेटा प्रदान करता है ।
बैक्टीरियल पालन में Vn की कार्यात्मक भूमिका का अध्ययन करने के लिए, दो अलग परख उपयोग किया जा सकता है । पहली परख यहां वर्णित Vn-लेपित गिलास सतहों के लिए बैक्टीरियल पालन के प्रत्यक्ष माप है, जबकि दूसरी परख उपकला कोशिकाओं की सतह के पालन की जांच करता है । पहली परख के लिए, कांच स्लाइड Vn के साथ लेपित थे, और WT या उत्परिवर्ती Hif उपभेदों के बंधन चना-दाग और माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इस तकनीक को आसानी से बांध Vn12की क्षमता के आधार पर बैक्टीरिया को अलग । स्तनधारी कोशिकाओं को बैक्टीरियल आसंजन तो प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के एक monolayer पर संस्कृतिपूर्ण बैक्टीरिया को जोड़ने के द्वारा विश्लेषण किया गया था; कालोनी बनाने वाली इकाइयों (CFUs) की संख्या की गिनती करके बैक्टीरियल लगाव का आकलन किया गया । पालन और आंतरिक बैक्टीरिया उपस्थिति या Vn4,13की अनुपस्थिति में प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
बैक्टीरियल सीरम प्रतिरोध में Vn अधिग्रहण की भूमिका एक सीरम हत्या की परख (यानी, सीरम जीवाणुनाशक गतिविधि) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था । सीरम प्रतिरोध में Vn अधिग्रहण के महत्व का आकलन करने के लिए, Vn समाप्त सीरम (VDS) की जीवाणुनाशक गतिविधि सामान्य मानव सीरम (एन एच एस) की तुलना में था. विधि आसानी से इस्तेमाल किया Vn-बंधन बनाम गैर बाध्यकारी बैक्टीरिया सीरम प्रतिरोध के आधार पर अलग । हम कई जीवाणु रोगजनकों के सीरम प्रतिरोध में Vn की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया4,12.
कई तरीकों होस्ट रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए सूचित किया गया है । यहां, हम प्रोटोकॉल का एक सेट है कि आसानी से किसी भी रोगज़नक़ के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्रम में रोगजनन में Vn की भूमिका का आकलन का वर्णन । हम विभिंन रोगजनकों का उपयोग कर इन प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, और Hif इस रिपोर्ट के लिए एक उदाहरण के रूप में चुना गया था ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल रोगजनकों सेल सतह के लिए भर्ती Vn और पूरक कारकों और झिल्ली हमले परिसर2के पूरा होने की स्थिति को रोकने के लिए इस नियामक का उपयोग । Vn भी बैक्टीरिया की सतह प्रोटीन और मेजबान सेल सतह रिसेप्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अन्ना और एडविन बर्जर, लार्स Hierta, O.E. और एदला जोहानसन फाउंडेशन, स्वीडिश चिकित्सा अनुसंधान परिषद (अनुदान संख्या K2015-57X-03163-43-4, www.vr.se), विश्वविद्यालय में कैंसर फाउंडेशन की नींव से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया माल्मो में अस्पताल, Physiographical सोसायटी (Forssman फाउंडेशन), और स्केन काउंटी परिषद के अनुसंधान और विकास फाउंडेशन ।
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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