細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金
Summary
このレポートでは、細菌の外膜タンパク質とひと補体レギュレータ ビトロネクチンの相互作用を特徴付けるためのプロトコルについて説明します。この結合反応およびビトロネクチン値の任意の細菌種の生物学的機能を研究するプロトコルを使用できます。
Abstract
細菌はホストの免疫反応を回避するための手段として補完するレギュレータを利用します。ここでは、ホストの免疫抵抗性の細菌の細胞の表面の再生の役割ビトロネクチン獲得を評価するためのプロトコルについて述べる。流れの cytometry の実験は、ヘモフィルスタイプ f の受容器の細菌外膜蛋白 H のリガンドとしてひと血漿ビトロネクチンを識別されます。酵素抗体法を用いて精製組換え蛋白質 H とビトロネクチン、蛋白質蛋白質の相互作用を特徴付けるし、バイオ層干渉法を用いて評価した結合親和性。正常およびビトロネクチン枯渇のひと血清で血清抵抗試金を使用してホストの免疫の回避の細菌の細胞表面タンパク質 H ビトロネクチンのバインディングの生物学的重要性を確認した.グラム染色に続いてビトロネクチン コーティングなしとスライド ガラスを使って細菌付着におけるビトロネクチンの重要性を調べた。最後に、ヒトの肺胞上皮細胞膜に細菌の付着を調べた。ここで説明されているプロトコルは興味の任意の細菌種の研究に容易に適応することができます。
Introduction
ビトロネクチン (Vn) は、線溶系の調節することによる恒常性の維持に関与する重要なひと糖です。Vn は 7 C5b6 複合体形成と C9 重合中に端末の補体経路を阻害することによって補完する調節因子としても機能します。いくつかの細菌性病原体は、抵抗補完沈着1,2,3の手段として細胞表面にヴァイオリンを募集する示されています。また、Vn は病原体2,4、5の内面化とホスト上皮細胞受容体、それによって促進付着細菌の「サンドイッチ」分子として機能します。Vn のバクテリアの細胞表面へのバインドは、他の現在正体不明の蛋白質によって媒介されます。完全にホースの免疫の回避で Vn バインディングの機能的役割の解明が必要になります (ヴァイオリン) 募集タンパク質の同定。
Vn 結合蛋白質を識別するに最初のステップは、関心の病原体は精製フローサイトメトリー ヴァイオリンをバインドできるかどうかをテストするのには、Vn が病原体のセルにバインドされているかどうかを決定するための便利で簡単な方法です。本研究では様々 なヘモフィルスタイプ f (Hif) 臨床分離株6の Vn の結合を評価しました。記載方法、定量細菌株の様々 の結合容量を区別するために使用することができます。以前の研究ではタンパク質 Hif の H (PH) を Vn 結合タンパク質7として特徴付けられます。したがって、本研究では野生型 (WT) Hif と Hif M10Δlphの突然変異体の Vn 結合のポテンシャルは、記述されていたプロトコルを用いて比較した.
Vn を病原体にバインドそれが決定されると、2 番目のステップは、潜在的な Vn 結合蛋白質を識別するために表面のプロテオームを特徴付けるためです。この目的8,9には、さまざまなアプローチを使用できますが、これらの方法論は、このレポートに記載されていません。Recombinantly大腸菌の選択した細菌の表面タンパク質の表現し、親和性クロマトグラフィーによる浄化する蛋白質蛋白質の相互作用を調べることに最も適した方法です。ここでは、メソッドを説明するために PH と Vn の分子相互作用を使用します。遺伝子組換えの PH とベトナム間の相互作用は、酵素免疫測定法 (ELISA)7とバイオ層干渉 (結合)10,11として知られている最近開発されたラベル無料手法を用いた特徴付けられました。Elisa は、タンパク質間相互作用を確認する使用ことができます、一方、バリは相互作用の速度論的パラメーターに関する詳細なデータを提供します。
細菌付着の Vn の機能的役割を勉強するには、2 つの異なるアッセイを利用できます。2 番目の分析検査上皮細胞の表面への付着に対し、ここで説明した最初の試金は Vn コーテッド ガラス表面の細菌付着の直接測定です。最初の試金のためスライド ガラスは、Vn でコーティングした、WT や Hif の突然変異系統のバインディングはグラム染色と顕微鏡で評価しました。この手法は、容易に Vn12をバインドする機能に基づく細菌を区別します。哺乳動物細胞への細菌の付着に II 型肺胞上皮細胞の単層培養菌を追加して分析しました。細菌付着がコロニー形成数を数えることによって評価されたユニット (CFUs)。付着、内面化された細菌は、Vn4,13の有無で区別できます。
Vn 細菌血清抵抗性獲得の役割は、(すなわち、血清殺菌) 血清殺害の試金を使用して評価しました。血清抵抗性で、Vn 買収の意義を評価するには、Vn 枯渇血清 (VDS) の殺菌活性は、正常ひと血清 (NHS) と比較した.容易に使用法は血清抵抗性に基づく拘束力のない細菌対 Vn バインディングを区別します。いくつかの細菌性病原体4,12の血清抵抗性の Vn の役割を研究するこのメソッドを使いました。
宿主-病原体相互作用を研究するための多数の方法を報告されています。ここでは、一連のすべての病原体の研究に Vn の病態での役割を評価するために簡単に合わせることができるプロトコルについて述べる。我々 は様々 な病原体を使用してこれらのプロトコルをテストし、Hif はこのレポートのための例として選ばれました。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌性病原体は、細胞表面に Vn を募集し、補足物の要因の成膜および膜の攻撃の複合体2の完了を防ぐためにこの補完するレギュレータを利用します。Vn は、上皮細胞の表面に付着し、その後内面化を仲介する病原体ができ細菌の表面タンパク質とホスト細胞の表面の受容器、ブリッジの分子としても機能します。本研究では血清抵抗性および強化を提供する i) へのバイン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アンナの財団とエドウィン ・ ベルガー、Lars Hierta、o. e.、Edla ・ ヨハンソン財団、スウェーデン医学研究評議会からの補助金によって支えられた (許可番号 K2015 57 X-03163-43-4、www.vr.se)、大学でがん財団マルメ ・家庭的社会 (性の基礎) とスコーネ郡評議会の研究・開発財団の病院。
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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