Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri
Summary
Bu rapor bakteriyel dış membran proteinlerinin ve insan tamamlayıcı regülatörü vitronectin arasındaki etkileşimler karakterize için iletişim kurallarını açıklar. İletişim kurallarını bağlama reaksiyonlar ve biyolojik fonksiyonu herhangi bir bakteri türlerinde vitronectin eğitim için kullanılabilir.
Abstract
Bakteri tamamlayıcı düzenleyiciler konak immün yanıt evading bir araç olarak kullanmaktadır. Burada, biz rol vitronectin edinme bakteri hücre yüzey çalış, direnç ana bağışıklık sistemi için değerlendirmek için protokol tanımlamak. Akış Sitometresi deneyler insan plazma vitronectin Haemophilus influenzae tip f bakteriyel reseptör dış membran protein H için bir ligand olarak teşhis etti. Bir enzim bağlı immunosorbent assay saflaştırılmış Rekombinant protein H ve vitronectin arasındaki protein-protein etkileşimler karakterize etmek için istihdam edildi ve benzeşme bağlama biyo-katman Interferometry kullanarak değerlendirildi. Vitronectin protein H Ana bilgisayar bağışıklık yanıtının kaçakçılığı bakteri hücre yüzeyinde bağlama biyolojik önemi bir serum direnç tahlil normal ve vitronectin tükenmiş insan serumu ile kullanarak teyit edildi. Vitronectin bakteriyel uyum içinde önemi ve vitronectin kaplama, Gram boyama tarafından takip olmadan cam slaytlar kullanılarak analiz. Son olarak, insan alveoler epitel hücre monolayers için bakteriyel yapışma araştırılmıştır. Burada açıklanan protokoller faiz bakteriyel herhangi bir tür çalışma odasına kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Vitronectin (Vn) önemli bir insan glikoprotein homeostazı, düzenleme, fibrinolitik sistem üzerinden sürdürmek için yer var. VN da C5b6-7 karmaşık oluşumu ve C9 polimerizasyon sırasında terminal tamamlayıcı yolu engelleyerek bir tamamlayıcı regülatör işlev görür. Birçok bakteriyel patojenler Vn hücre yüzeyine karşı kompleman birikimi1,2,3aracı olarak işe gösterilmiştir. Buna ek olarak, bakteri ve ana bilgisayar epitel hücre reseptörleri, böylece teşvik bağlılık ve patojenler2,4,5içselleştirilmesi arasında bir “sandviç” molekül Vn görür. Vn bağlama bakteri hücre yüzeyine Şu anda kimliği belirsiz diğer proteinler tarafından aracılık ettiği. Vn-hortum bağışıklık yanıtının kaçakçılığı bağlamasında işlevsel rolü tam olarak elucidating bu nedenle kimlik Vn-işe proteinlerin gerektirir.
Vn bağlanıcı proteinler belirlenmesinde ilk adım bir patojen ilgi arıtılmış Vn. akış sitometresi bağlayabilirsiniz olup olmadığını sınamak için Vn patojen hücrelere bağlı olup olmadığını belirlemek için uygun ve basit bir yöntem olmasıdır. Bu çalışmada, Vn bağlamaya çeşitli Haemophilus influenzae tip f (kurulan) klinik yalıtır6değerlendirildi. Burada açıklanan yöntemi kantitatif ve çok çeşitli bakteri suşları bağlama kapasitesi ayırt etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, protein H (PH) kurulan bir Vn bağlayıcı protein7olarak karakterize. Bu nedenle, mevcut çalışmada, yaban tipi (WT) kurulan ve kurulan M10Δlph mutantlar Vn-bağlama potansiyelini karşılaştırıldığında açıklanan protokolleri kullanarak.
Bir patojen Vn bağlar belirlendikten sonra olası Vn bağlanıcı proteinler tanımlamak için yüzey Proteom karakterize ikinci adımıdır. Yaklaşımlar çeşitli bu amaç8,9için kullanılabilir, ancak bu metodolojileri bu raporda açıklanan değildir. Protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi için en uygun recombinantly E. coli seçilen bakteri yüzey proteinleri hızlı ve benzeşme Kromatografi tarafından arındırmak için yöntemidir. Burada, PH ve moleküler etkileşim Vn ile belgili tanımlık yöntem göstermek için kullanırız. Rekombinant PH ve Vn arasındaki etkileşimler bir enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)7 ve biyo-katman Interferometry (BLI)10,11bilinen son zamanlarda gelişmiş bir etiket içermeyen tekniği kullanılarak karakterize. ELISAs protein-protein etkileşimleri onaylamak için kullanılan ise saçınıza etkileşimlerin kinetik parametreleri ile ilgili ayrıntılı verileri sağlar.
Vn işlevsel rolü bakteriyel uyum içinde çalışmak için iki farklı deneyleri yararlı olabilir. Burada açıklanan ilk tahlil Vn kaplı cam yüzeyler, bakteriyel bağlılık doğrudan ölçülmesi ise ikinci tahlil yüzey epitel hücrelerinin bağlılığı inceliyor. İlk tahlil için cam slaytlar Vn ile kaplı ve bağlama WT veya mutant kurulan suşları Gram boyası ve mikroskopi tarafından değerlendirildi. Bu teknik kolayca bakterileri Vn12bağlama yeteneği göre ayırt eder. Memeli hücre bakteriyel yapışma o zaman kültürlü bakteri türü II alveoler epitel hücresi monolayer üzerine ekleyerek analiz edildi; bakteriyel eki değerlendirildi koloni oluşturan sayısını sayarak birimleri (CFUs). Yapıştırılan ve içselleştirilmiş bakteri Vn4,13içinde ayırt edici olabilir.
Bakteriyel serum direnç Vn edinme rolünün bir serum öldürme tahlil (yani, serum bakterisidal etkinlik) kullanılarak değerlendirilmiştir. Serum direnç www.cdc.gov/drugresistance Vn edinme önemini değerlendirmek için Vn tükenmiş bir serum (VDS) bakterisidal etkinlik bu normal insan serumu (NHS) ile karşılaştırıldı. Kolayca kullanılan yöntem Vn-bağlama karşı bağlayıcı bakterileri serum direnci üzerinde göre ayırt eder. Vn rolde birkaç bakteriyel patojenler4,12serum direnç eğitim için bu yöntemi kullandık.
Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitimi için çok sayıda yöntem bildirilmiştir. Burada, kolayca herhangi bir patojen çalışma odasına Vn rol patogenezinde değerlendirmek için adapte edilebilir iletişim kuralları kümesi açıklar. Bu protokoller çeşitli patojenler kullanarak test ettik ve kurulan bu rapor için bir örnek olarak seçildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel patojenler Vn hücre yüzeyine için recruit ve kompleman faktörler birikimi ve membran saldırı karmaşık2tamamlanmasını önlemek için bu tamamlayıcı regülatör kullanmaktadır. VN aynı zamanda bakteri yüzey proteinleri ve konak hücre yüzey reseptörlerinin, arasında bir köprü molekül olarak böylece patojenler epitel hücrelerinin yüzeyine uygun ve daha sonra içselleştirilmesi arabuluculuk etkinleştirme çalışır. Bu çalışmada serum direnci ve enhancement-in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Anna Vakfı ve Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. ve Edla Johansson Vakfı, İsveçli Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir (sayı K2015-57 X-03163-43-4, vermek www.vr.se), kanser Vakfı Üniversitesi’nde Malmö, Physiographical toplum (Forssman’ın Vakfı) ve Skåne County Konseyi araştırma ve Geliştirme Vakfı hastanede.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
