Assays til at studere rollen, som Vitronectin i bakteriel adhæsion og Serum modstand
Summary
Denne rapport beskriver protokoller for kendetegner interaktioner mellem bakteriel ydre Membranproteiner og menneskelige supplement regulator vitronectin. Protokollerne kan bruges til at studere den bindende reaktioner og biologiske funktion af vitronectin i enhver bakteriearter.
Abstract
Bakterier udnytte supplement regulerende myndigheder som et middel til at unddrage sig vært immunresponset. Her beskriver vi protokoller for at vurdere den rolle vitronectin erhvervelse på bakteriel celle overflade spiller i modstand på vært immunsystemet. Flow flowcytometri eksperimenter identificeret humant plasma vitronectin som en ligand for bakteriel receptor ydre membran protein H af Haemophilus influenzae type f. En enzym-forbundet immunosorbent assay var ansat til at karakterisere protein-protein interaktioner mellem renset rekombinante protein H og vitronectin, og bindende affinitet blev vurderet ved hjælp af bio-lag interferometri. Den biologiske betydning af bindingen af vitronectin til protein H på bakteriel celleoverfladen i unddragelse af immunrespons vært blev bekræftet ved hjælp af en serum modstand assay med normale og vitronectin-forarmet humant serum. Betydningen af vitronectin i bakteriel tilslutning blev analyseret ved hjælp af glas lysbilleder, med og uden vitronectin belægning, efterfulgt af Gram farvning. Endelig, bakteriel adhæsion til menneskelige alveolær epitelcelle encellelag blev undersøgt. De protokoller er beskrevet her kan tilpasses nemt til studiet af enhver bakteriel arter af interesse.
Introduction
Vitronectin (Vn) er en vigtig menneskelige glycoprotein involveret i at opretholde homeostase via regulering af det fibrinolytiske system. VN også fungerer som et supplement regulator ved at hæmme terminal komplement pathway under C5b6-7 kompleks dannelse og C9 polymerisering. Flere bakterielle patogener har vist at rekruttere Vn til cellens overflade som et middel til at modstå supplement deposition1,2,3. Derudover fungerer Vn som en “sandwich” molekyle mellem bakterier og vært epitelcelle receptorer, dermed fremme overholdelse og internalisering af patogener2,4,5. Bindingen af Vn til bakteriel cellens overflade er medieret af andre i øjeblikket uidentificerede proteiner. Fuldt belyse Vn-bindingen i unddragelse af immunrespons slange funktionelle rolle vil derfor kræve identifikation af Vn-rekruttering proteiner.
Det første skridt i at identificere Vn-bindende proteiner er at teste, om en patogen interesse kan binde renset Vn. flowcytometri er en praktisk og enkel metode til at afgøre, om Vn er bundet til patogen celler. I denne undersøgelse vurderet vi bindingen af Vn til forskellige Haemophilus influenzae type f (Hif) kliniske isolater6. Den metode beskrevet heri er kvantitative og kan bruges til at skelne den bindende kapacitet af en bred vifte af bakterielle stammer. I en tidligere undersøgelse karakteriseret vi protein H (PH) i Hif som en Vn-bindende protein7. Derfor, i den nuværende undersøgelse, Vn-bindende potentialet i wild-type (WT) Hif og Hif M10Δlph mutanter blev sammenlignet ved hjælp af protokollerne beskrevet.
Når det er fastslået, at en patogen binder Vn, er det andet skridt at karakterisere overflade proteomet for at identificere potentielle Vn-bindende proteiner. En lang række metoder kan bruges til dette formål8,9, men disse metoder er ikke beskrevet i denne betænkning. Den metode, der er mest velegnet til at undersøge protein-protein interaktioner er recombinantly express udvalgte bakteriel overflade proteiner i E. coli og rense af affinitet kromatografi. Her bruger vi PH og dens molekylære interaktion med Vn for at illustrere metoden. Interaktioner mellem rekombinant PH og Vn var karakteriseret ved hjælp af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)7 og en nyligt udviklede etiket-gratis teknik kendt som bio-lag interferometri (BLI)10,11. Mens ringprøver kan bruges til at bekræfte protein-protein interaktioner, indeholder BLI detaljerede data om de kinetiske parametre af interaktioner.
For at studere Vn funktionelle rolle i bakteriel tilslutning, kan to forskellige assays udnyttes. Den første assay beskrevet her er direkte måling af bakteriel tilslutning til Vn-belagt glasoverflader, mens den anden analyse undersøger tilslutning til overfladen af epitelceller. For det første assay, glas dias var belagt med Vn, og bindingen af WT eller Hif mutantstammen blev vurderet af Gram-pletten og mikroskopi. Denne teknik adskiller let bakterier baseret på evnen til at binde Vn12. Bakteriel adhæsion til pattedyrceller blev derefter analyseret ved at tilføje kulturperler bakterier på en éncellelag af type II alveolær epitelceller; bakteriel vedhæftet fil blev vurderet ved at tælle antallet af kolonidannende enheder (CFUs). Overholdt og internaliseret bakterier kan skelnes i tilstedeværelse eller fravær af Vn4,13.
Rollen af Vn erhvervelse i bakteriel serum modstand blev evalueret ved hjælp af en serum drab assay (dvs., serum bakteriedræbende aktivitet). For at vurdere betydningen af Vn erhvervelse i serum modstand, var det bakteriedræbende aktivitet af Vn-forarmet serum (VDS) sammenlignet med normale humant serum (NHS). Metoden anvendes let adskiller Vn-bindende versus ikke-bindende bakterier baseret på serum modstand. Vi brugte denne metode til at studere Vn rolle i serum modstand på flere bakterielle patogener4,12.
Talrige metoder er blevet rapporteret til at studere vært-patogen interaktioner. Her, beskriver vi et sæt af protokoller, der kan tilpasses nemt til studiet af enhver patogen for at vurdere Vn rolle i patogenesen. Vi har testet disse protokoller ved hjælp af forskellige patogener, og Hif blev valgt som et eksempel for denne betænkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterielle patogener rekruttere Vn til cellens overflade og udnytte dette supplement regulator for at undgå aflejring af supplement faktorer og færdiggørelse af membran angreb komplekse2. VN også fungerer som en bro molekyle mellem bakteriel overflade proteiner og vært celle overfladen receptorer, således at patogener til at holde sig til overfladen af epitelceller og efterfølgende formidle internalisering. I denne undersøgelse beskriver vi protokoller, der kan bruges til at anslå i) bin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra fonden Anna og Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. og Edla Johansson Foundation, den svenske Medical Research Council (give nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Cancer Foundation ved universitetet Hospital i Malmø, Physiographical samfund (Forssman’s Foundation), og Skåne County Council Research og Development Foundation.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
