We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.
Fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie van specifieke biomoleculen in cellen. Voor conventionele fluorescentiemicroscopie de ruimtelijke resolutie beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak en> 500 nm langs de optische as. Daardoor fluorescentiemicroscopie al lang ernstig beperkt in de waarneming van ultrastructurele kenmerken in cellen. De recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie methoden heeft deze beperking te omzeilen. Met name de komst van photoswitchable fluoroforen maakt lokalisatie-based super resolutie microscopie, die oplossend vermogen het naderen van de moleculaire lengte schaal biedt. Hier beschrijven we de toepassing van een drie-dimensionale super-resolutie microscopie methode op basis van single-molecule lokalisatie microscopie en multifase interferometrie, genaamd interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM). Deze methode biedt bijna isotrope resolutie over deorde van 20 nm in alle drie dimensies. Protocollen voor het visualiseren van de filamenteuze actine cytoskelet, waaronder prepareren en de werking van het instrument iPALM, worden hier beschreven. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aan te passen en leerzaam voor de studie van andere ultrastructurele functies in cellen.
De visualisatie van complexe celstructuren is al lang een integraal onderdeel van de biologische inzichten en ontdekking. Hoewel fluorescentie microscopie afbeeldingscellen met hoog moleculair specificiteit, het oplossend vermogen wordt beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak (x, y, of dwarsafmeting) en> 500 nm langs de optische as (z of axiale afmeting) 1,2. Vandaar dat de observatie van ultrastructurele kenmerken van oudsher beperkt tot elektronenmicroscopie (EM). Gelukkig heeft de recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie deze limiet omzeild, waardoor ruimtelijke resolutie in de 10-100 nm 1-6. In het bijzonder, benaderingen super resolutie op basis van één molecuul lokalisatie, bekend onder acroniemen zoals PALM (Photoactivated Localization Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence Photoactivated Localization Microscopy) 5 (d) STORM (direct Stochastic Optical Wederopbouw Microscopy) 6,7, PAINT ( point accumulatie for Imaging Nanoscale Topografie) 8, GSDIM (grondtoestand Uitputting Microscopy, gevolgd door individuele moleculaire return) 9 of SMACM (single-molecule Active-Control Microscopy) 10, evenals hun 3-dimensionale (3D) implementaties, zoals interferometrische PALM (iPALM) 11 of 3D-STORM 12, zijn waardevol in het onthullen van nieuwe inzichten in de nanoschaal organisatie van een groot aantal biologische structuren, met inbegrip van neuronale axonen en synapsen 13, focale adhesies 14,15, cel-cel kruispunten 16, nucleaire poriën 17 en centrosomes 18-20, een paar te noemen.
Een andere ultrastructurele functie in cellen voor die super-resolutie microscopie is potentieel bruikbaar is het actine cytoskelet. Het complex maaswerk van filamenteuze (f) actine in de cel cortex speelt een essentiële rol in de controle van celvorm en mechanische eigenschappen 21. De organisatie of f-actine wordt actief en dynamisch geregeld al tal van regulerende eiwitten die sterk beïnvloeden polymerisatie, verknoping, omzet, stabiliteit en netwerktopologie 22. Hoewel de karakterisering van F-actine maaswerk architectuur is belangrijk mechanistische inzichten in een diversiteit aan cellulaire processen, de kleine (~ 8 nm) van de f-actine filamenten belemmert de waarneming door gebruikelijke buigingsbegrensde lichtmicroscopie; dus de visualisatie van actine fijne structuur tot nu toe uitsluitend uitgevoerd door EM. Hier beschrijven we protocollen voor het visualiseren van de f-actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen, met behulp van de iPALM super resolutie microscopie techniek om te profiteren van de zeer hoge precisie capaciteit te nemen in 3D 11,23. Hoewel de iPALM instrument sterk gespecialiseerd heeft instructies over het opzetten van een dergelijk instrument is beschreven onlangs 23, terwijl de toegang tot de iPALM microscoop georganiseerd door de Howard Hughes Medical Institute is ook ter beschikking gesteld van de onderzoeksgemeenschap met minimale kosten. Bovendien, het prepareren hierin beschreven werkwijzen zijn direct toepasbaar op alternatieve 3D superresolutie benaderingen, zoals die gebaseerd op astigmatisch onscherpte in de puntspreidingsfunctie (PSF) 12 of bi-plane detectie 24, die breder beschikbaar zijn.
We merken op dat een noodzakelijk ingrediënt voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie in het algemeen is de photoswitchable fluorofoor 25, waarin de drie kritische eisen voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie maakt het mogelijk moet worden voldaan: i) high single-molecule helderheid en contrast ten opzichte achtergrondsignalen; ii) spaarzame distributie van enkele moleculen in een gegeven beeldframe; en iii) hoge ruimtelijke dichtheid etikettering voldoende om het profiel van de onderliggende structuur (ook bekend als Nyquist-Sha vangennNiet sampling criterium) 26. Zo bevredigende resultaten nadruk liggen eveneens op zowel de goede voorbereiding van monsters geplaatst fluorofoor photoswitching optimaliseren en de onderliggende ultrastructuur behouden, evenals de instrumentatie en verwervingsprocessen van de experimenten.
Het optische systeem iPALM is gebaseerd op een 4-π dual-tegen objectief ontwerp, zoals weergegeven in figuur 1A. De instellingen worden geconstrueerd met zowel maat gefreesd en commerciële opto-mechanische onderdelen, zoals eerder beschreven 23 en in tabel 1. In aanvulling op onze opstelling, het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) biedt onderdak aan een systeem dat toegankelijk is voor de wetenschappelijke wereld op het Advanced Imaging Center van de Ja…
The authors have nothing to disclose.
YW en PK zeer erkentelijk voor financiële steun van de Singapore National Research Foundation, toegekend aan PK (NRF-NRFF-2011-04 en NRF2012NRF-CRP001-084). We danken ook de MBI geopende lab en microscopie kernfaciliteiten voor ondersteunende infrastructuur.
optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
baseplate | local workshop | customized | |
turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |