Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)
Summary
Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada convencional.
Abstract
Microscopía de fluorescencia permite la visualización directa de biomoléculas específicas dentro de las células. Sin embargo, para la microscopía de fluorescencia convencional, la resolución espacial está limitada por difracción a ~ 200 nm dentro del plano de la imagen y> 500 nm a lo largo del eje óptico. Como resultado, la microscopía de fluorescencia ha sido durante mucho tiempo muy limitada en la observación de características ultraestructurales de las células. El reciente desarrollo de métodos de microscopía súper resolución ha de superar esta limitación. En particular, el advenimiento de fluoróforos photoswitchable permite súper resolución microscopía basada en la localización, que proporciona el poder de resolución acercarse a la escala de longitud molecular. A continuación, describimos la aplicación de un método de resolución de la microscopía de súper tridimensional basado en una sola molécula de microscopía de localización y la interferometría de fases múltiples, llamado interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm). Este método proporciona una resolución casi isotrópica en elorden de 20 nm en las tres dimensiones. Los protocolos para visualizar el citoesqueleto de actina filamentosa, incluyendo la preparación de muestras y el funcionamiento del instrumento iPalm, se describen aquí. Estos protocolos son también fácilmente adaptable e instructivo para el estudio de otras características ultraestructurales de las células.
Introduction
La visualización de las estructuras celulares complejas ha sido durante mucho tiempo parte integral de conocimientos biológicos y descubrimiento. Aunque la microscopía de fluorescencia puede celdas de imagen con especificidad molecular alto, su poder de resolución está limitada por la difracción a ~ 200 nm en el plano de la imagen (x, y, o dimensión lateral) y> 500 nm a lo largo del eje óptico (z, o dimensión axial) 1,2. Por lo tanto, la observación de características ultraestructurales históricamente se ha limitado a la microscopía electrónica (EM). Afortunadamente, el reciente desarrollo de la resolución microscopía de súper ha eludido este límite, lo que permite una resolución espacial en el 10 – 100 nm rango de 1-6. En particular, súper resolución enfoques basados en la localización de una sola molécula, conocida por las siglas como el de palma (photoactivated localización Microscopy) 4, FPALM (Fluorescencia photoactivated localización Microscopy) 5 (d) STORM (directa estocástico óptico Reconstrucción Microscopía) 6,7, PAINT ( CorreosLa acumulación int for Imaging nanoescala Topografía) 8, GSDIM (estado fundamental Agotamiento Microscopía seguido por el retorno moleculares individuales) 9, o SMACM (Single-molécula activa-Control Microscopía) 10, así como sus implementaciones de 3 dimensiones (3D), como PALM interferométrica (iPalm) 11 o 3D-STORM 12, han sido valiosa para revelar nuevos conocimientos sobre la organización a nanoescala de numerosas estructuras biológicas, incluyendo los axones neuronales y las sinapsis 13, adhesiones focales, 14,15 célula-célula cruces 16, 17 poros nucleares centrosomas, y 18-20, para nombrar unos pocos.
Otra característica ultraestructural en células para las que la resolución microscopía Super es potencialmente útil es el citoesqueleto de actina. La malla complejo de (f) actina filamentosa en la corteza celular juega un papel esencial en el control de la forma celular y las propiedades mecánicas 21. La organización of f-actina se encuentran activa y dinámicamente regulado, aunque numerosas proteínas reguladoras que influyen fuertemente en la polimerización, reticulación, la facturación, la estabilidad y la topología de la red 22. Sin embargo, a pesar de la caracterización de la arquitectura de malla de actina F es importante para conocimientos mecánicos en una amplia gama de procesos celulares, el pequeño tamaño (~ 8 nm) de los filamentos de actina F dificulta su observación por microscopía de luz de difracción limitada convencional; Por lo tanto, la visualización de la estructura fina de la actina hasta ahora se ha realizado exclusivamente por EM. A continuación, describimos los protocolos para la visualización del citoesqueleto de actina F en células de mamíferos adherentes, utilizando la técnica de microscopía de súper resolución iPalm para aprovechar su capacidad muy alta precisión en 3D 11,23. Aunque el instrumento iPalm está altamente especializado, instrucción sobre la creación de un instrumento de este tipo ha sido descrito recientemente 23, mientras que el acceso al microscopio iPalm organizada por el Howard Hughes Medical Institute también se ha puesto a disposición de la comunidad investigadora con un costo mínimo. Además, los métodos de preparación de muestras descritos en este documento son directamente aplicables a enfoques alternativos 3D Super Resolution, tales como los basados en desenfoque astigmática de la función de dispersión de punto (PSF) 12 o biplano de detección 24, que son más ampliamente disponible.
Observamos que un ingrediente necesario para la resolución de la microscopía de súper basada en la localización de una sola molécula, en general, es el fluoróforo photoswitchable 25, que permite que los tres requisitos críticos para la microscopía de súper resolución basada en la localización de una sola molécula de cumplirse: i) alta sola molécula brillo y el contraste con respecto a las señales de fondo; ii) la distribución dispersa de moléculas individuales en un marco de imagen dada; y iii) la densidad espacial alta de etiquetado suficiente para captar el perfil de la estructura subyacente (también conocido como Nyquist-Shacriterio de muestreo nnon) 26. Por lo tanto, para obtener resultados satisfactorios, se debe hacer hincapié por igual en ambos la preparación adecuada de las muestras para optimizar photoswitching fluoróforo y para preservar la ultraestructura subyacente, así como en los aspectos de instrumentación y adquisición de los experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema óptico de iPalm se basa en un diseño de doble objetivo opuesto 4-π, como se muestra en la Figura 1A. La configuración se construye con piezas mecanizadas tanto a medida y comerciales opto-mecánico, como se ha descrito anteriormente 23 y que figuran en la Tabla 1. Además de nuestra configuración, el Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) aloja un sistema que es accesible a la comunidad científica en el Centro de Imagen Avanzada en el Campus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YW y PK agradecen el apoyo financiero de la Fundación de Investigación Nacional de Singapur, adjudicado a PK (NRF-NRFF-2011-04 y NRF2012NRF-CRP001-084). Agradecemos también a los abiertos instalaciones de laboratorio y de núcleo microscopía MBI para apoyo a la infraestructura.
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
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