干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡
Summary
私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。
Abstract
蛍光顕微鏡は、細胞内の特定の生体分子の直接可視化を可能にします。しかし、従来の蛍光顕微鏡法のために、空間分解能は、光軸に沿って像面、> 500nmの範囲内〜200nmの回折により制限されています。結果として、蛍光顕微鏡法は、長い細胞内の超微細構造の特徴の観察に厳しく制限されています。超解像顕微鏡法の最近の開発は、この制限を克服しました。特に、photoswitchable蛍光体の出現は、分子長さスケールに近づいて解像力を提供ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を、可能にします。ここでは、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）と呼ばれる単一分子の局在顕微鏡法および多相干渉に基づいて3次元超解像顕微鏡法の適用を説明します。この方法は、上のほぼ等方性の解像度を提供しますすべての3つの次元で20nmのオーダー。 iPALM機器の試料調製及び動作を含む、繊維状アクチン細胞骨格を可視化するためのプロトコルは、ここに記載されています。これらのプロトコルはまた、細胞内の他の超微細構造の特徴の研究に容易に適合し、有益です。
Introduction
複雑な細胞構造の可視化は、長い生物学的洞察と発見に不可欠となっています。蛍光顕微鏡は、高分子特異性を有する画像セルは、その分解能は〜像面（X、Y、または横寸法）で200 nmの光軸（Z、または軸方向の寸法）に沿って、> 500nmの回折によって制限されることができるが1,2。したがって、超微細な特徴の観察は、歴史的に、電子顕微鏡（EM）に限られていました。 100 nmの範囲1-6 -幸いなことに、超解像顕微鏡の最近の開発は、10の空間分解能を可能にする、この制限を回避しています。具体的には、超解像は、このようなPALM（光活性化ローカライゼーション顕微鏡）4、FPALM（蛍光光活性化ローカライゼーション顕微鏡）5（d）にSTORM（直接確率的光学再構築顕微鏡）などの頭字語によって知られている単一分子の局在化に基づくアプローチ6,7、PAINT（ポー川int型イメージングナノスケールの地形のための蓄積）8、GSDIM（基底状態枯渇顕微鏡は、個々の分子のリターンが続く）9、またはSMACM（単一分子アクティブ制御顕微鏡）10、ならびに、それらの3次元（3D）の実装、干渉PALM（iPALM）11または3D-STORM 12、神経細胞の軸索とシナプス13を含む多数の生物学的構造のナノスケールの組織に新たな洞察を明らかに貴重なされている、接着斑14,15、細胞間結合16、核膜孔17 、および中心体18-20は 、いくつかの名前を付けます。
超解像顕微鏡は、潜在的に有用であるために、細胞内の別の超微細構造の特徴は、アクチン細胞骨格です。細胞表層における糸状（F）アクチンの複雑な網目構造は、細胞の形状及び機械的特性21の制御において重要な役割を果たしています。組織OF F-アクチンは、積極的かつ動的に強く重合、架橋、売上高、安定性、およびネットワークトポロジー22に影響を与える多数の調節タンパク質も規制されています。 F-アクチン網目構造のキャラクタリゼーションは、細胞プロセスの多様な範囲に機械的な洞察のために重要であるものの、F-アクチンフィラメントの小さいサイズ（〜8 nm）は、従来の回折限界光学顕微鏡によって自分の観察を妨げます。従って、アクチン微細構造の可視化は、これまでもっぱらEMによって実行されています。ここでは、3D 11,23における非常に高精度の能力を活用するiPALM超分解能顕微鏡技術を用いて、接着性哺乳動物細胞におけるF-アクチン細胞骨格を可視化するためのプロトコルを説明します。 iPALM機器は専門性の高いですがiPALM顕微鏡へのアクセスはホーによってホストされている一方で、このような機器の設定に関する指示は、23最近記載されています病棟・ヒューズ医学研究所はまた、最小限のコストとの研究コミュニティに利用可能とされています。さらに、本明細書に記載の試料調製方法は、より広範に利用可能であるような点広がり関数（PSF）の非点収差のデフォーカスに基づくものなどの代替的な3D超解像手法、12又はバイプレーン検出24、に直接適用可能です。
私たちは、一般的には単一分子の局在化ベースの超解像顕微鏡のために必要な成分が満たされなければ、単一分子の局在化ベースの超解像顕微鏡のための3つの重要な要件を可能にするphotoswitchableフォア25、であることに注意した：i）高単一分子背景信号の明るさとコントラストの相対。 ⅱ）所与の画像フレーム内の単一分子のまばらな分布。また、ナイキスト・沙として知られている根本的な構造（のプロファイルをキャプチャするのに十分な標識及びiii）高い空間密度nnonサンプリング基準）26。このように、満足のいく結果を得るために、重点はフルオロフォアphotoswitchingを最適化するために、基礎となる超微細構造を維持するための試験片の適切な準備の両方で、同様の実験の計測および買収側面に均等に配置する必要があります。
Protocol
1.イメージング試料の準備ので、バックグラウンド蛍光信号が最初に脱イオン水（のddH 2 O）でそれらをすすぎ、次いで圧縮空気を使用して空気乾燥させてカバーガラスを清掃し、フルオロフォア標識からの蛍光を妨害します。その後、15秒間プラズマクリーナープラズマエッチングを行う、または必要に応じてより長いです。 ドリフト補正とiPALMキャリブレーションを?…
Representative Results
iPALMのための重要な要件は、光学系のアライメント、登録、およびキャリブレーションされています。これらは、z座標の抽出に3ウェイビームスプリッタ必要内の適切な干渉を確実にするために必要です。継続的な監視を有効にするには、蛍光の一定の点光源が必要です。これは、蛍光のAu又はそのフォトルミネッセンス局在表面プラズモン共鳴（LSPR）から生じる二?…
Discussion
図1（a）に示すようiPALMの光学系は、4-πデュアル対向対物レンズの設計に基づいています。 表 1に先に23を説明し、記載されている設定は、カスタム機械加工や商業の両方の光学機械部品を用いて構成されています。私たちのセットアップに加えて、ハワード・ヒューズ医学研究所（HHMI）がJaneliaリサーチキャンパスでの高度なイメージングセン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YWとPKは感謝PK（NRF-NRFF-2011-04とNRF2012NRF-CRP001-084）に授与シンガポール国立研究財団から資金援助を認めます。また、インフラストラクチャのサポートのためのMBIオープンラボと顕微鏡の中核施設に感謝します。
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. 생화학. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
Cite This Article
Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).