हम इंटरफेरोमेट्रिक Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (iPALM), एक 3-आयामी एकल अणु स्थानीयकरण सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी विधि के आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं में actin cytoskeleton की इमेजिंग के लिए। यह दृष्टिकोण nanoscale ढांचागत सुविधाओं है कि अन्यथा पारंपरिक विवर्तन सीमित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अनसुलझे रहेगा की प्रकाश आधारित दृश्य की अनुमति देता।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट biomolecules के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। हालांकि, पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, स्थानिक संकल्प विवर्तन से ~ 200 एनएम के लिए छवि विमान और ऑप्टिकल अक्ष के साथ> 500 एनएम के भीतर ही सीमित है। नतीजतन, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लंबे गंभीर रूप से कोशिकाओं के भीतर ultrastructural सुविधाओं के अवलोकन में सीमित कर दिया गया है। सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तरीकों का हाल ही में विकास इस सीमा को पार किया है। विशेष रूप से, photoswitchable fluorophores के आगमन स्थानीयकरण के आधार पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, जो शक्ति को हल आणविक-लंबाई पैमाने के करीब पहुंच प्रदान करता है सक्षम बनाता है। यहाँ, हम एक तीन आयामी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और अवस्थायाँ इंटरफेरोमेट्री पर आधारित पद्धति, इंटरफेरोमेट्रिक Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (iPALM) कहा जाता है के आवेदन का वर्णन है। इस विधि पर लगभग isotropic संकल्प प्रदान करता हैसभी तीन आयामों में 20 एनएम का आदेश। filamentous actin cytoskeleton visualizing, नमूना तैयार करने और iPALM साधन के आपरेशन के लिए प्रोटोकॉल सहित, यहाँ वर्णित हैं। इन प्रोटोकॉल भी आसानी से निभा सकते हैं और कोशिकाओं में अन्य ultrastructural सुविधाओं के अध्ययन के लिए शिक्षाप्रद हैं।
जटिल सेलुलर संरचनाओं के दृश्य लंबे जैविक अंतर्दृष्टि और डिस्कवरी का अभिन्न अंग रहा है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उच्च आणविक विशिष्टता के साथ छवि कोशिकाओं, अपनी शक्ति को हल छवि विमान में ~ 200 एनएम (एक्स, वाई, या पार्श्व आयाम) और> 500 एनएम ऑप्टिकल अक्ष के साथ (जेड, या अक्षीय आयाम) को विवर्तन द्वारा सीमित है सकते हैं, यद्यपि 1,2। इसलिए, ultrastructural सुविधाओं का अवलोकन ऐतिहासिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तक सीमित कर दिया गया है। सौभाग्य से, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का हाल ही में विकास इस सीमा धोखा दिया गया है, 10 में स्थानिक संकल्प को सक्षम करने – 100 एनएम रेंज 1-6। विशेष रूप से, सुपर संकल्प एक अणु स्थानीयकरण, इस तरह के पाम (Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) 4, FPALM (प्रतिदीप्ति Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) 5 (घ) तूफान (प्रत्यक्ष Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी) 6.7, पेंट (के रूप परिवर्णी शब्द से जाना जाता है पर आधारित दृष्टिकोण पोइमेजिंग नेनो स्थलाकृति) 8 के लिए int संचय, GSDIM (जमीन राज्य कमी माइक्रोस्कोपी व्यक्ति आणविक वापसी के बाद) 9, या SMACM (एकल अणु सक्रिय नियंत्रण माइक्रोस्कोपी) 10, साथ ही उनके 3-आयामी (3 डी) जैसे कार्यान्वयन, इंटरफेरोमेट्रिक पाम (iPALM) 11 या 3 डी तूफान 12, कई जैविक संरचनाओं के nanoscale संगठन में उपन्यास अंतर्दृष्टि का खुलासा, न्यूरोनल एक्सोन सहित मूल्यवान किया गया है और 13 synapses, फोकल adhesions 14,15, सेल सेल जंक्शनों 16, परमाणु pores 17 है और centrosomes 18-20, एक ही नाम है।
जो कोशिकाओं के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी संभावित रूप से उपयोगी है में एक और ultrastructural सुविधा actin cytoskeleton है। सेल कोर्टेक्स में filamentous (च) -actin के जटिल meshwork सेलुलर आकार और यांत्रिक गुणों 21 के नियंत्रण में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। संगठन ओएफ एफ actin सक्रिय रूप से और गतिशील हालांकि कई नियामक प्रोटीन है कि दृढ़ता से polymerization, तिर्यक, कारोबार, स्थिरता, और नेटवर्क टोपोलॉजी 22 को प्रभावित विनियमित है। हालांकि, हालांकि एफ actin meshwork वास्तुकला के लक्षण वर्णन सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज, छोटे आकार (~ 8 एनएम) एफ actin तंतु की पारंपरिक विवर्तन सीमित प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने प्रेक्षण बाधित में यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, actin ठीक संरचना के दृश्य अब तक विशेष रूप से ईएम द्वारा प्रदर्शन किया गया है। यहाँ, हम, पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं में एफ actin cytoskeleton visualizing iPALM सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर 3 डी 11,23 में इसकी बहुत उच्च परिशुद्धता क्षमता का लाभ लेने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन। हालांकि iPALM साधन अत्यधिक विशिष्ट है, इस तरह के एक साधन की स्थापना पर अनुदेश हाल ही में 23 में वर्णित किया गया है, जबकि iPALM माइक्रोस्कोप Ho से मेजबानी के लिए उपयोगवार्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट भी कम से कम लागत के साथ अनुसंधान समुदाय के लिए उपलब्ध कराया गया है। इसके अतिरिक्त, नमूना तैयार करने के साथ साथ वर्णित विधि सीधे ऐसी बात फैल समारोह (पीएसएफ) की अविन्दुक defocusing के आधार पर उन के रूप में वैकल्पिक 3 डी सुपर संकल्प दृष्टिकोण, 12 या द्वि-विमान का पता लगाने के 24 है, जो अधिक मोटे तौर पर उपलब्ध हैं के लिए लागू कर रहे हैं।
हम ध्यान दें कि सामान्य तौर पर एकल अणु स्थानीयकरण के आधार पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए एक आवश्यक घटक photoswitchable fluorophore 25 है, जो एकल अणु स्थानीयकरण के आधार पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए तीन महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा करने की अनुमति देता है: i) उच्च एकल अणु चमक और पृष्ठभूमि संकेतों के विपरीत रिश्तेदार; ii) एक दिया छवि फ्रेम में एकल अणुओं की विरल वितरण; और iii) लेबलिंग आधारभूत संरचना (भी Nyquist शा के रूप में जाना की प्रोफाइल पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त के उच्च स्थानिक घनत्वगैर- नमूने कसौटी), 26। इस प्रकार, संतोषजनक परिणाम के लिए, जोर समान रूप से दोनों नमूनों की समुचित तैयारी पर fluorophore photoswitching अनुकूलन करने के लिए और अंतर्निहित फैटी संरक्षित करने के लिए, साथ ही प्रयोगों के उपकरण और अधिग्रहण पहलुओं पर रखा जाना चाहिए।
IPALM के ऑप्टिकल प्रणाली, एक 4-π दोहरे विरोध के उद्देश्य डिजाइन पर आधारित है के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। के रूप में पहले 23 में वर्णित है और 1 टेबल में सूचीबद्ध सेटअप, दो…
The authors have nothing to disclose.
YW और पी कृतज्ञता सिंगापुर नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, पीके (एनआरएफ-NRFF-2011-04 और NRF2012NRF-CRP001-084) को सम्मानित किया धन से समर्थन स्वीकार करते हैं। हम यह भी बुनियादी सुविधाओं के समर्थन के लिए MBI खुली प्रयोगशाला और माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा धन्यवाद।
optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
baseplate | local workshop | customized | |
turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |