입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

Yilin Wang; Pakorn Kanchanawong

doi:10.3791/54774

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방법 논문

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

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DOI:

10.3791/54774

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2016년 12월 1일

Yilin Wang¹ , Pakorn Kanchanawong²^,³

¹Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, ²Mechanobiology Institute, Singapore, ³Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

이 논문에서

요약

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

초록

형광 현미경은 세포 내 특정 생체 분자를 직접 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 종래의 형광 현미경, 공간 해상도는 광축을 따라 결상면과> 내지 500nm에서 ~ 200 nm의 회절에 의해 제한된다. 결과적으로, 형광 현미경은 오랫동안 심각한 세포 내 미세 기능의 관찰에 한정되었다. 초 해상 현미경 방법의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고있다. 특히, 광전 환성 형광체의 출현 분자 길이 스케일에 접근 해상력을 제공하는 기반 지역화 초 해상 현미경을 가능하게한다. 여기서는 간섭계 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM)이라는 단일 분자 파악 현미경 다상 간섭에 기초하여 입체 초 해상 현미경 법의 적용을 설명한다. 이 방법은에 거의 등방성 해상도를 제공세 가지 차원에서 20 나노 미터의 순서. iPALM 악기의 시료 준비 및 운영을 포함하여 사상 액틴 세포 골격을 시각화 프로토콜, 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포에서 다른 미세 구조 기능 연구에 쉽게 적응과 교훈입니다.

서론

복잡한 세포 구조의 시각화는 오랫동안 생물 통찰력과 발견을 통합하고있다. 형광 현미경은, 그 해상력이 ~ 200 화상면에 나노 (X, Y, 또는 측 방향 치수) 및> 500 nm의 광학 축 방향 (Z, 또는 축 방향 치수)에 회절 고분자 특이성 화상 세포 제한 할 수 있지만 ^{1, 2.} 따라서, 미세 기능 관찰 역사적 전자 현미경 (EM)로 제한되어왔다. 100 nm의 범위 ^1-6 - 다행히, 슈퍼 해상도 현미경의 최근 발전은 10에서 공간 해상도를 가능하게,이 제한을 회피했다. 특히, 슈퍼 해상도는 같은 PALM (광 활성화 현지화 현미경) ^4, FPALM은 (형광 광 활성화 현지화 현미경) ⁵ (d)에 STORM (직접 확률 광학 재건 현미경) ^{6, 7,} PAINT (같은 약어로 알려진 단일 분자 현지화에 기반 접근 방법 포이미징 나노 지형) ⁸ INT의 축적은, GSDIM (접지 상태 고갈 현미경 ⁹⁾ 개별 분자 반환 한 다음, 또는 SMACM (단일 분자 액티브 제어 현미경) ^(10),뿐만 아니라 그들의 3 차원 (3D) 구현, 간섭 PALM (iPALM) ¹¹ 3D-STORM ^(12)는 신....