Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l'ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression
Summary
Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d'une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l'ARN-seq.
Abstract
Dans la maladie de Parkinson (PD), il y a une perte neuronale répandue dans le cerveau avec une dégénérescence marquée des neurones dopaminergiques dans le snc, conduisant à la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. L'identification des neurones dopaminergiques vivant dans ventral mésencéphalique (VM) des cultures primaires en utilisant un marqueur fluorescent fournit une autre façon d'étudier la vulnérabilité sélective de ces neurones sans compter sur la immunocoloration des cellules fixes. Ici, nous isoler, dissocier, et les neurones VM de souris de culture pendant 3 semaines. Nous identifions alors les neurones dopaminergiques dans les cultures en utilisant eGFP fluorescence (entraînée par un promoteur Tyrosine hydroxylase (TH)). neurones individuels sont récoltés dans des tubes à centrifuger à l'aide de micropipettes de verre. Ensuite, nous Lyse des cellules récoltées, et nous effectuons la synthèse d'ADNc et transposon médiée "tagmentation" pour produire seule cellule ARN-Seq bibliothèques 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Après avoir passé une vérification de contrôle de qualité, les bibliothèques unicellulaires sont séquencées et l'analyse ultérieure est réalisée pour mesurer l'expression génique. Nous présentons les résultats transcriptome pour dopaminergique individuel et neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP qui ont été recueillies et ont été séquencées neurones dopaminergiques. Ces techniques auront des applications répandues dans les neurosciences et la biologie moléculaire.
Introduction
Maladie de Parkinson (PD) est une maladie incurable liée à l'âge neurodégénérative. La cause de ce trouble relativement courant reste mal comprise. Il y a une perte généralisée des neurones dans le cerveau, avec la dégénérescence neuronale prononcée des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra (SNC), conduisant à des caractéristiques cliniques de diagnostic de la bradykinésie, la rigidité et les tremblements.
cultures mixtes primaires contenant des neurones dopaminergiques SNc sont particulièrement pertinents pour la maladie de Parkinson. Ventral tegmentale Area (VTA) neurones dopaminergiques ont été impliqués dans la récompense et la dépendance. Ventral mésencéphalique (VM) cultures embryonnaires mixtes primaires contiennent à la fois les neurones Snc VTA dopaminergique (DA) et les neurones GABAergiques. VM cultures primaires peuvent être utiles pour des essais de neuroprotection et d'élucider la vulnérabilité sélective des neurones dopaminergiques. Il n'y a aucun moyen fiable pour identifier les cellules dopaminergiques dans la culture en fonction de la morphologie. Ilre nous développons des techniques pour identifier et récolter les neurones dopaminergiques simples, et de construire une seule cellule, à rendement élevé des bibliothèques de séquençage de l'ARN.
Nous rapportons les données ARN transcriptomiques représentatives pour dopaminergique unique et les neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Ce protocole peut être utilisé pour la neuroprotection, la neurodégénérescence, et les dosages pharmacologiques pour étudier les effets de divers traitements sur le transcriptome DA / GABA. Parce que les neurones dopaminergiques représentent une petite minorité des neurones exprimés dans les cultures primaires VM, la capacité à identifier de manière fiable ces neurones dans les cultures vivantes permettra une gamme élargie d'études unicellulaires. Ces nouvelles techniques faciliteront les progrès dans la compréhension des mécanismes qui se déroulent au niveau cellulaire et peuvent avoir des applications ailleurs dans les domaines des neurosciences et de la biologie moléculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous isolons des cellules individuelles à partir d'une population hétérogène utilisant un marqueur fluorescent, puis étudier chaque cellule avec une seule cellule ARN-seq. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP que nous récoltés et séquencés étaient neurones dopaminergiques en effet, en fonction de la présence des trois transcrits du gène DA liées suivantes, TH, DDC et SLC6A3. Toutes les cellules positives TH-eGFP ont exprimé ces trois gènes évalués par l'ARN-Seq. Cela …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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