Summary

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

Published: February 10, 2017
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Summary

パーキンソン病(PD)では、黒質(SNC)ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。

Abstract

パーキンソン病(PD)で動作緩慢、硬直、振戦につながるのSNcにおけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な変性と脳全体広まっ神経細胞の損失があります。蛍光マーカーを使用して、プライマリ腹側中脳(VM)の文化に住んでドーパミン作動性ニューロンの同定は、固定した細胞の免疫染色に頼ることなく、これらのニューロンの選択的脆弱性を研究するための代替方法を提供します。ここでは、単離、解離、および培養マウスVMニューロン3週間。私たちは、その後、(チロシンヒドロキシラーゼ(TH)プロモーターによって駆動される)eGFP蛍光を用いて、培養物中のドーパミン作動性ニューロンを識別します。個々のニューロンは、ガラスマイクロピペットを用いて、マイクロ遠心チューブに回収します。次に、我々は採取した細胞を溶解し、単一細胞RNA-のSeqライブラリ1、2生成するために、cDNA合成およびトランスポゾン媒介」tagmentation」を実施しますお尻= "外部参照"> 3、4、5。品質管理チェックを通過した後、単一細胞ライブラリーを配列決定され、その後の分析は、遺伝子発現を測定するために行われます。私たちは、個々のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのためのトランスクリプトームの結果を報告します。私たちは、収穫し、配列決定したライブTH-EGFP細胞の100%がドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。これらの技術は、神経科学および分子生物学において広範な用途を持つことになります。

Introduction

パーキンソン病(PD)は、不治の、年齢関連神経変性疾患です。この比較的一般的な障害の原因はよくわかっていないままです。脳全体広まっニューロンの損失は緩慢、硬直及び振戦の診断臨床的特徴につながる、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な神経変性(SNC)と、があります。

SNCドーパミン作動性ニューロンを含む初代混合培養物は、パーキンソン病のために特に関連しています。腹側被蓋領域(VTA)ドーパミン作動性ニューロンは報酬と中毒に関与しています。腹側中脳(VM)の一次混合胚の培養は、SNCとVTAのドーパミン作動性(DA)ニューロン及びGABA作動性ニューロンの両方を含みます。 VM初代培養物は、神経保護アッセイに有用であることができ、ドーパミン作動性ニューロンの選択的脆弱性を明らかにすること。形態に基づいて、培養中のドーパミン作動性細胞を同定する信頼できる方法はありません。彼再我々は特定し、収穫単一ドーパミン作動性ニューロンを、および単一セル、高収量RNAシーケンシングライブラリーを構築するための技術を開発します。

我々は、単一のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのための代表的なRNAトランスクリプトームデータを報告しています。このプロトコルは、DA / GABAのトランスクリプトームの様々な治療の効果を研究するため、神経保護、神経変性、および薬理学的アッセイのために使用することができます。ドーパミン作動性ニューロンは、一次VM培養で発現したニューロンの少数を代表しているので、確実に生きている培養物中のこれらのニューロンを同定する能力は、単一細胞研究の強化された範囲を可能にします。これらの新規の技術は、細胞レベルで起こるメカニズムの理解の進歩を促進し、他の場所で神経科学と分子生物学の分野での用途を有することができます。

Protocol

注:全ての実験は、国立衛生研究所により提供される動物の管理と使用に関するガイドラインに従って行った、およびプロトコルはカリフォルニア工科大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 マウス胎児の脳からの初代ドーパミン作動性細胞培養の1導出ソリューションおよび培養培地アスコルビン酸原液の調製アスコルビン酸の352?…

Representative Results

ここでは、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター配列によって駆動されたeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqの( 図1)を使用して、それらのRNAトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。データを収集し、配列決定したTH-EGFP陽性細胞の100%?…

Discussion

ここでは、単一細胞RNA-seqの各セルを研究、蛍光タグを使用して、不均一な集団から単一細胞を単離。私たちは、私たちが収穫し、配列決定し、ライブTH-EGFP細胞の100%は、次の3つのDA関連遺伝子の転写産物、TH、DDCおよびSLC6A3の存在に基づいて、実際にドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.

Materials

Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X Gibco  14175-095
Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
L-Ascorbic acid Sigma  A7506
B27 Gibco  17504-044 50 X stock solution, 1 X final concentration.
35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
Laminin Sigma  L2020 Stored at -20°C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
Blue pipette tips Sorenson Bioscience,  Inc. 10130
P1000
10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
37°C Water bath
37°C, 5% humidity incubator
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
Triton X-100 Sigma  X100-500ML
Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
Forceps – 2×3 teeth Fine Science Tools 11022-14
Forceps – Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
10X PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X Gibco 14190-144 500 ml 
21 guage needle  BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
Micropipette puller Sutter Instrument. model P-87
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit
oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
50X 2 polymerase mix 50X Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
10X PCR buffer 10X Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
RNA Spikes ThermoFisher 4456740
PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack.
DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110rxns
Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5ml
RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.)
Microforge Narishige (or equivalent) 
Sequencer Illumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

References

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Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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