Summary

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Published: February 10, 2017
doi:

Summary

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

Abstract

Na doença de Parkinson (DP) não há perda neuronal generalizada em todo o cérebro com a degeneração dos neurónios dopaminérgicos pronunciada no Snc, levando a bradicinesia, rigidez e tremores. A identificação dos que vivem neurônios dopaminérgicos em culturas primárias Ventral mesencefálico (VM) usando um marcador fluorescente fornece uma forma alternativa para estudar a vulnerabilidade seletiva desses neurônios sem depender da imunocoloração das células fixas. Aqui, isolamos, dissociar e cultura rato neurônios VM para 3 semanas. Em seguida, identificar os neurónios dopaminérgicos em culturas usando eGFP fluorescência (conduzido por um promotor Tirosina Hidroxilase (TH)). neurónios individuais são colhidas em tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidro. A seguir, lisar as células colhidas, e realizar a síntese de cDNA e "tagmentation" mediada por transposão para produzir bibliotecas de ARN-Seq monocelulares 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Depois de passar uma verificação de controlo de qualidade, as bibliotecas de uma única célula são sequenciados e subsequente análise é realizada para medir a expressão do gene. Nós relatamos resultados transcriptoma para dopaminérgico individual e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que foram colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos. Essas técnicas terão vastas aplicações em neurociência e biologia molecular.

Introduction

Doença de Parkinson (DP) é, uma doença neurodegenerativa incurável relacionada com a idade. A causa desta doença relativamente comum permanece mal compreendido. Há uma perda generalizada neuronal em todo o cérebro, com a degeneração neuronal acentuada de neurónios dopaminérgicos da substância negra (SNC), levando a características clínicas de diagnóstico de bradicinesia, rigidez e tremor.

culturas mistas primárias contendo neurônios dopaminérgicos SNc são especialmente relevantes para a doença de Parkinson. Ventral tegmental Área (VTA) neurônios dopaminérgicos têm sido implicados na recompensa e vício. Ventral mesencefálico (VM) culturas embrionárias mistos primários contêm ambos os neurônios SNC ou a VTA dopaminérgico (DA) e neurônios GABAérgicos. VM culturas primárias podem ser úteis para ensaios de neuroproteção e para elucidar a vulnerabilidade selectiva dos neurónios dopaminérgicos. Não há nenhuma maneira confiável para identificar células dopaminérgicas na cultura com base na morfologia. Elere desenvolvemos técnicas para identificar e colher neurónios dopaminérgicos individuais e construir uma única célula, de alto rendimento bibliotecas RNA sequenciamento.

Relatamos dados RNA transcriptoma representativos para única dopaminérgica e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Este protocolo pode ser utilizado para a neuroprotecção, a neurodegeneração, e os ensaios farmacológicos para estudar os efeitos de vários tratamentos no transcriptoma DA / GABA. Porque neurônios dopaminérgicos representam uma pequena minoria dos neurônios expressas em culturas primárias de VM, a capacidade de identificar com segurança esses neurônios em culturas que vivem permitirá uma gama avançada de estudos de uma única célula. Essas técnicas inovadoras facilitar avanços na compreensão dos mecanismos que ocorrem no nível celular e pode ter aplicações em outros lugares nos campos da biologia molecular e neuroscience.

Protocol

NOTA: Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e uso de animais fornecidos pelos Institutos Nacionais de Saúde e protocolos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal no Instituto de Tecnologia da Califórnia. 1. Derivação da Primária dopaminérgicos culturas celulares embrionárias mouse Cérebro Soluções e Meio de Cultura Preparação de Ácido Ascórbico da Solução Pesar 352 mg de ?…

Representative Results

Aqui relatamos um protocolo para a cultura de neurónios do mesencéfalo ventral de um ratinho que expressam eGFP accionado por uma sequência de promotor de tirosina-hidroxilase, colhendo neurónios fluorescentes individuais a partir das culturas, e medindo a sua transcriptoma de ARN utilizando ARN-SEQ (Figura 1). Os dados mostraram que 100% das células TH-eGFP-positivos que foram colhidas e sequenciados eram neurónios dopaminérgicos, com base na presença dos três …

Discussion

Aqui nós isolar células individuais de uma população heterogênea, utilizando uma etiqueta fluorescente, em seguida, estudar cada célula com uma única célula de RNA-seq. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos, de facto, com base na presença dos três transcritos de genes relacionados com DA seguintes, TH, DDC e SLC6A3. Todas as células positivas TH-EGFP expressa estes três genes como avaliado pela RNA-Seq. Este foi concordante com os estudo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.

Materials

Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X Gibco  14175-095
Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
L-Ascorbic acid Sigma  A7506
B27 Gibco  17504-044 50 X stock solution, 1 X final concentration.
35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
Laminin Sigma  L2020 Stored at -20°C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
Blue pipette tips Sorenson Bioscience,  Inc. 10130
P1000
10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
37°C Water bath
37°C, 5% humidity incubator
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
Triton X-100 Sigma  X100-500ML
Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
Forceps – 2×3 teeth Fine Science Tools 11022-14
Forceps – Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
10X PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X Gibco 14190-144 500 ml 
21 guage needle  BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
Micropipette puller Sutter Instrument. model P-87
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit
oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
50X 2 polymerase mix 50X Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
10X PCR buffer 10X Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
RNA Spikes ThermoFisher 4456740
PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack.
DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110rxns
Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5ml
RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.)
Microforge Narishige (or equivalent) 
Sequencer Illumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

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Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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