Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression
Summary
При болезни Паркинсона (PD), черной субстанции (ВНС) дофаминергические нейроны дегенерируют, что приводит к моторной дисфункции. Здесь мы сообщаем протокол для культивирования вентральных нейронов среднего мозга от мыши, выражающей EGFP с приводом от Тирозингидроксилаза (TH) промоторной последовательности, собирая отдельные флуоресцентные нейроны из культур, и измеряя их транскриптом с использованием Секвенирование РНК.
Abstract
При болезни Паркинсона (БП) широко распространена потеря нейронов по всему мозгу с выраженной дегенерацией дофаминергических нейронов в ВНС, что ведет к Брадикинезия, ригидности и тремора. Идентификация живых дофаминергических нейронов в первичных Брюшной мезенцефалической (VM) культур с использованием флуоресцентного маркера обеспечивает альтернативный способ изучить избирательная уязвимость этих нейронов, не полагаясь на иммунное фиксированных клеток. Здесь мы изолируем, диссоциируют, и культура мыши VM нейроны в течение 3 недель. Затем определить дофаминергических нейронов в культурах с использованием EGFP флуоресценции (направляемый Тирозингидроксилаза (TH) промотор). Отдельные нейроны собирают в микропробирок с использованием стекла микропипетки. Далее, мы лизировать собранные клетки, а также проводить синтез кДНК и транспозонов-опосредованной "tagmentation" для получения однородной клеточной РНК-Seq библиотеки 1, 2,попка = "Xref"> 3, 4, 5. После прохождения проверки контроля качества, библиотеки одноклеточные упорядочиваются и последующий анализ проводится для измерения экспрессии генов. Мы сообщаем Транскриптом результаты для отдельных дофаминергической и ГАМКергических нейронов, выделенных из среднемозговых культур. Мы сообщаем, что 100% живых клеток TH-EGFP, которые были собраны и секвенированию дофаминергические нейроны. Эти методы будут иметь широкое применение в неврологии и молекулярной биологии.
Introduction
Болезнь Паркинсона (БП) является неизлечимым, связанная с возрастом нейродегенеративное расстройство. Причина этого довольно распространенным заболеванием остается плохо изученным. Существует широкое потеря нейронов по всему мозгу, с выраженной дегенерации нейронов дофаминергических нейронов в черной субстанции (ВНС), что приводит к диагностических клинических признаков Брадикинезия, жесткости и тремора.
Первичные смешанные культуры, содержащие дофаминергических нейронов SNc особенно важны для лечения болезни Паркинсона. Брюшной тегментальной Площадь (VTA) дофаминергических нейронов были вовлечены в награду и наркомании. Брюшной мезенцефалической (VM) первичные смешанные эмбриональные культуры содержат как SNc и VTA дофаминергическая (DA) нейронов и ГАМКергических нейронов. VM первичные культуры могут быть полезны дл нейропротекции анализов и выяснения селективное уязвимости дофаминергических нейронов. Там нет никакого надежного способа идентифицировать дофаминергические клеток в культуре на основе морфологии. Онре мы разрабатываем методы для выявления и сбора урожая отдельных нейронов дофаминергические и построить одноклеточные, высокопродуктивные библиотеки РНК секвенирования.
Мы сообщаем репрезентативные данные РНК транскриптом для одного дофаминергической и ГАМКергических нейронов, выделенных из среднемозговых культур. Этот протокол может быть использован для нейропротекции, нейродегенеративных и фармакологических анализов для изучения влияния различных обработок на транскриптома DA / ГАМК. Поскольку дофаминергические нейроны представляют собой незначительное меньшинство нейронов, выраженных в первичных культурах VM, способность надежно идентифицировать эти нейроны в живых культур позволит расширенный диапазон исследований одноклеточных. Эти новые методы будут способствовать прогресс в понимании механизмов, происходящих на клеточном уровне и может иметь применение в других местах в области нейронауки и молекулярной биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы выделяем отдельные клетки из гетерогенной популяции с использованием флуоресцентной метки, а затем изучить каждую клетку с одноклеточного Секвенирование РНК. Мы сообщаем, что 100% живых клеток TH-EGFP, что мы заготовленной и секвенированию, в самом деле дофаминергические нейроны, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
