Pålidelig Identifikation af Living dopaminerge neuroner i midthjernen Cultures Brug RNA Sequencing og TH-promotor-drevet eGFP Expression
Summary
Ved Parkinsons sygdom (PD), sorte substans (SNC) dopaminerge neuroner degenerere, hvilket fører til motorisk dysfunktion. Her rapporterer vi en protokol til dyrkning ventrale midthjernen neuroner fra en mus, der udtrykker eGFP drevet af en tyrosinhydroxylase (TH) promotorsekvens, høst individuelle fluorescerende neuroner fra kulturerne, og måling af deres transkriptom anvendelse af RNA-seq.
Abstract
Ved Parkinsons sygdom (PD) der er udbredt neurontab hele hjernen med udtalt degeneration af dopaminerge neuroner i SNC, hvilket fører til bradykinesi, rigiditet og tremor. Identifikationen af levende dopaminerge neuroner i ubearbejdet ventrale mesencephaliske (VM) kulturer ved hjælp af en fluorescerende markør giver en alternativ måde at studere den selektive sårbarhed disse neuroner uden at henvise til immunfarvning af faste celler. Her, vi isolerer, dissocierer, og kultur muse VM neuroner i 3 uger. Vi derefter identificere dopaminerge neuroner i kulturer under anvendelse eGFP fluorescens (drevet af en tyrosinhydroxylase (TH) promoter). Individuelle neuroner høstes i mikrocentrifugerør ved anvendelse af glas mikropipetter. Dernæst vi lysere høstede celler og udføre cDNA-syntese og transposon-medieret "tagmentation" til at producere enkeltcelle-RNA-Seq biblioteker 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Efter at have passeret en kvalitetskontrol check, er encellede biblioteker sekventeret og efterfølgende analyse udføres for at måle genekspression. Vi rapporterer transkriptom resultater for individuel dopaminerge og GABAerge neuroner isoleret fra midthjernen kulturer. Vi rapporterer, at 100% af de levende TH-eGFP-celler, der blev høstet og sekventeret var dopaminerge neuroner. Disse teknikker vil have udbredt anvendelse i neurovidenskab og molekylærbiologi.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en uhelbredelig, aldersrelateret neurodegenerativ lidelse. Årsagen til denne relativt almindelig lidelse forbliver dårligt forstået. Der er udbredt neurontab hele hjernen, med udtalt neuronal degeneration af dopaminerge neuroner i substantia nigra (SNC), hvilket fører til diagnostiske kliniske træk ved bradykinesi, stivhed og tremor.
Primære blandede kulturer indeholdende SNC dopaminerge neuroner er især relevante for Parkinsons sygdom. Ventrale tegmentalområde (VTA) dopaminerge neuroner har været impliceret i belønning og afhængighed. Ventrale mesencephaliske (VM) primære blandede embryonale kulturer indeholder både SNC og VTA dopaminerge (DA) neuroner og GABAerge neuroner. VM primære kulturer kan være nyttigt for neurobeskyttelse assays og til at belyse den selektive sårbarhed af dopaminerge neuroner. Der er ikke nogen pålidelig måde at identificere dopaminerge celler i kultur baseret på morfologi. Hanre vi udvikler teknikker til at identificere og høste enkelt dopaminerge neuroner, og konstruere encellede, højt forrentede RNA sekventering biblioteker.
Vi rapporterer repræsentative RNA transkriptom data for enkelt dopaminerge og GABAerge neuroner isoleret fra midthjernen kulturer. Denne protokol kan anvendes til neurobeskyttelse, neurodegeneration, og farmakologiske assays til at undersøge virkningerne af forskellige behandlinger på DA / GABA transkriptom. Fordi dopaminerge neuroner udgør et lille mindretal af de neuroner, der er udtrykt i primære VM kulturer, vil evnen til pålideligt identificere disse neuroner i levende kulturer muliggøre en forbedret vifte af encellede undersøgelser. Disse hidtil ukendte teknikker vil lette fremskridt i forståelsen af mekanismerne, der finder sted på celleniveau og kan have anvendelser andetsteds inden for neurovidenskab og molekylærbiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her isolere vi enkeltceller fra en heterogen population ved anvendelse af et fluorescerende mærke, derefter studere hver celle med enkelt-celle-RNA-seq. Vi rapporterer, at 100% af de levende TH-eGFP celler, som vi høstet og sekventeret var faktisk dopaminerge neuroner, baseret på tilstedeværelsen af følgende tre DA-relaterede gentranskripter, TH, DDC og slc6a3. Alle de TH-eGFP-positive celler udtrykte disse tre gener som bedømt ved RNA-Seq. Dette var overensstemmende med elektrofysiologiske undersøgelser, d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
