Pålitelig Identifikasjon av Bo dopaminerge nevroner i midthjernen kulturer Bruke RNA sekvensering og TH-promoter-drevet EGFP Expression
Summary
I Parkinsons sykdom (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge nevroner utarte, som fører til motorisk dysfunksjon. Her rapporterer vi en protokoll for dyrking av ventral midthjernen nerveceller fra en mus som uttrykker EGFP drevet av en tyrosinhydroksylase (TH) promotorsekvens, høsting individuelle fluorescerende nevroner fra kulturer, og måle deres transkriptom bruker RNA-seq.
Abstract
I Parkinsons sykdom (PD) er det utbredt neuronalt tap i hele hjernen med uttalt degenerasjon av dopaminerge neuroner i SNC, som fører til bradykinesi, stivhet og skjelving. Identifiseringen av levende dopaminerge nevroner i primær Ventralt mesencefalisk (VM) kulturer ved hjelp av en fluoriserende fargestoff gir en alternativ måte å studere den selektive sårbarhet disse nevronene uten å stole på farging av faste celler. Her kan vi isolere, distansere, og kultur mus VM nevroner i 3 uker. Deretter identifiserer dopaminerge neuroner i kulturene ved hjelp av EGFP fluorescens (drevet med en tyrosinhydroksylase (TH) promoter). Individuelle nevroner høstes inn mikrosentrifugerør bruker glass mikropipetter. Deretter lysere vi de høstede cellene, og gjennomføre cDNA syntese og transposon-mediert "tagmentation" for å fremstille enkelt-celle RNA-Seq biblioteker 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Etter å ha passert en kvalitetskontroll sjekk, er encellede biblioteker sekvensert og påfølgende analyse er gjennomført for å måle genuttrykk. Vi rapporterer transkriptom resultater for enkelte dopaminerge og gabaergic nevroner isolert fra midthjernen kulturer. Vi rapporterer at 100% av de levende TH-EGFP celler som ble høstet og sekvensert var dopaminerge nevroner. Disse teknikkene vil ha utbredte applikasjoner i nevrovitenskap og molekylærbiologi.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er en uhelbredelig, aldersrelatert nevrodegenerativ lidelse. Årsaken til denne relativt vanlig lidelse forblir dårlig forstått. Det er utbredt neuronal tap i hele hjernen, med markert neuronal degenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra (SNC), som fører til diagnostiske kliniske funksjoner i bradykinesi, rigiditet og tremor.
Primære blandede kulturer inneholder SNC dopaminerge nevroner er spesielt relevant for Parkinsons sykdom. Ventral tegmentale Area (VTA) dopaminerge nevroner har vært innblandet i belønning og avhengighet. Ventral mesencefalisk (VM) primær blandede embryonale kulturer inneholde både SNC og VTA dopaminerge (DA) nevroner og gabaergic nevroner. VM primærkulturer kan være nyttig for nevrobeskyttelse analyser og for å klargjøre den selektive sårbarheten av dopaminerge neuroner. Det er ingen pålitelig måte å identifisere dopaminerge celler i kultur basert på morfologi. Hanre vi utvikler teknikker for å identifisere og høste enkelt dopaminerge nevroner, og konstruere encellede, high-yield RNA sekvensering biblioteker.
Vi rapporterer representative RNA transkriptom data for enkelt dopaminerge og gabaergic nevroner isolert fra midthjernen kulturer. Denne protokollen kan brukes til nevro, nevrodegenerasjon, og farmakologiske analyser for å studere effekten av ulike behandlinger på DA / GABA transkriptom. Fordi dopaminerge nevroner representerer et lite mindretall av nevroner uttrykt i primær VM kulturer, vil evnen til å pålitelig identifisere disse nevronene i levende kulturer muliggjøre en utvidet spekter av encellede studier. Disse nye teknikkene vil lette fremskritt i forståelsen av mekanismene som finner sted på cellenivå, og kan ha anvendelser andre steder innen nevro og molekylærbiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her isolere vi enkeltceller fra en heterogen befolkning med en fluoriserende tag, deretter studere hver celle med encellede RNA-seq. Vi rapporterer at 100% av de levende TH-EGFP celler som vi høstet og sekvensert var faktisk dopaminerge nevroner, basert på tilstedeværelsen av følgende tre DA-relaterte genet transkripsjoner, TH, DDC og slc6a3. Alle de Th-EGFP-positive celler uttrykte disse tre genene som bedømt ved RNA-Seq. Dette var konkordant med elektrofysiologiske studier som viste at hver TH-EGFP celle vises og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
