Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
La replicazione del genoma si verifica durante la fase S del ciclo cellulare in un processo altamente regolato che assicura la fedeltà di duplicazione del DNA. Ogni regione genomica si replica in un momento distinto durante la fase S attraverso l'attivazione simultanea di più origini di replicazione. Tempo di replica (RPT) correla con molte caratteristiche genomiche ed epigenetici ed è collegato a tassi di mutazione e il cancro. Comprendere la visualizzazione completa del genoma del programma di replica, in salute e malattia è un importante obiettivo futuro e una sfida.
Questo articolo descrive in dettaglio il "Numero rapporto di riproduzione di S / G1 per la mappatura genomica tempo di replica" il metodo (di seguito denominato: CNR-Tor), un approccio semplice per mappare il genoma ToR di cellule di mammifero. Il metodo si basa sulle differenze del numero di copie tra le cellule in fase S e le cellule in fase G1. Il metodo CNR-TOR viene eseguita in 6 fasi: 1. Preparazione delle cellule e colorazione con ioduro di propidio (PI); 2. Sorting G1 cellule nella fase S utilizzando cellule di fluorescenza-attivato (FACS); 3. purificazione del DNA; 4. Sonicazione; 5. preparazione biblioteca e sequenziamento; e 6. L'analisi bioinformatica. Il metodo CNR-TOR è un approccio facile e veloce che si traduce in mappe dettagliate di replica.
Introduction
replicazione del DNA Mammalian è strettamente regolata per assicurare la replica esatta di ciascun cromosoma esattamente una volta durante il ciclo cellulare. La replica avviene secondo un ordine altamente regolamentato – più grandi regioni genomiche (~ Mb) replicano all'inizio della fase S (inizio replicare i domini), mentre altre regioni genomiche replicano dopo a (domini media e tarda replicanti) medio o tarda fase S 1. La maggior parte del genoma replicati contemporaneamente in tutti i tessuti (domini ToR costitutive), mentre il 30% – 50% del genoma, cambia ToR tra tessuti 2, durante la differenziazione 3, 4 e, in misura minore, anche durante trasformazione di cancro 5 . Inoltre, alcune regioni genomiche replicano asincrono 6, 7, 8, cioè vi è una differenzanel capitolato tra i due alleli.
ToR correla con molte caratteristiche genomiche e epigenomiche compresi i livelli di trascrizione, contenuto GC, lo stato della cromatina, la densità genica, ecc 1, 9. TR è anche associato con tassi di mutazione e tipi 10, 11 e quindi non sorprende, perturbazioni del programma di replica sono collegati al cancro 12, 13. La relazione causale tra Tor e la struttura della cromatina non è ancora capito. E 'possibile che aperto cromatina facilita replica presto. Tuttavia, un modello alternativo suggerisce che la cromatina è assemblato durante la replica e le diverse autorità di regolamentazione cromatina presenti all'inizio e alla fine di piombo fase S al differenziale confezionamento delle regioni replicanti precoce e tardiva 1, 14 </sup>. Abbiamo recentemente dimostrato che i TR modella il contenuto di GC influenzando il tipo di mutazioni che si verificano in diverse regioni genomiche 11.
Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è il metodo principale per la misurazione ToR a loci individuale. Si esegue semplicemente contando la percentuale di cellule in fase S che presentano segnali FISH singoli contro la percentuale di doppietti per un dato allele 15, 16. Un metodo alternativo, costituito da impulsi etichettatura del DNA con BrdU, l'ordinamento delle cellule in base al loro contenuto di DNA a più punti di tempo lungo S, immunoprecipitating DNA contenente BrdU, e controllando l'abbondanza di DNA precipitato con qPCR 17.
mappatura ToR genomico può essere raggiunto in due modi. Il primo metodo è una versione genomico del metodo basato BrdU-IP sopra descritta, in cui la quantificazione della quantitàdi DNA precipitato in ogni frazione viene effettuata contemporaneamente per l'intero genoma mediante ibridazione di microarray o sequenziamento. Il secondo metodo, CNR-TOR, si basa sulla misurazione il numero di copie di ciascuna regione genomica delle cellule in fase S e normalizzazione dal contenuto di DNA nelle cellule G1. In questo metodo, le cellule sono ordinati per FACS in non-replicante (fase G1) e replicare (fase S) gruppi (Figura 1). Le cellule in G1 hanno lo stesso numero di copie in tutte le regioni genomiche e quindi il loro contenuto di DNA dovrebbero essere gli stessi. D'altra parte, il numero di copie di DNA in S dipende TR, poiché le regioni replicanti primi sottoposti replicazione in maggior parte delle cellule e quindi il loro contenuto di DNA è raddoppiata, considerando che le regioni tardive replicanti non hanno ancora replicato in maggior parte delle cellule e quindi il loro contenuto di DNA sarà essere simile a quello delle cellule G1. Quindi il rapporto S G1 del contenuto di DNA è indicativa dei TR. La quantità di DNA per ciascuna regione genomica è misurata mediante ibridazionemicroarrays o dal sequenziamento profondo 2, 8. I vantaggi del metodo CNR-TR saranno ulteriormente discussi.
Questo documento descrive il metodo CNR-TOR per la mappatura genomica TR come descritto nella Figura 2. L'articolo discute i piccoli dettagli di tutto il processo dalla raccolta delle cellule fino a quando l'analisi di base dei risultati e la creazione di mappe genomiche Tor. Il protocollo descritto in questo documento è stata eseguita con successo su vari tipi di cellule in coltura. Futuri miglioramenti di questo protocollo può portare alla mappatura del capitolato in vivo e in tipi di cellule rare.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-tor può essere eseguita in linea di principio su una popolazione di cellule proliferanti eucariotiche che può essere diviso per FACS a S e le fasi G1 (recensito da Rhind N. e Gilbert 20 DM). Il metodo descritto qui è stato adattato per le cellule di mammifero con una dimensione del genoma di ~ 3 Gb come uomo e topo. Sono necessari Piccoli cambiamenti nel protocollo CNR-TR (in preparazione cellulare e profondità sequenziamento), al fine di adeguare ad altri eucarioti. L'attenzione deve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Oriya Vardi per l'assistenza nella generazione di figure. Il lavoro del gruppo è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (Grant No. 567/10) e il Consiglio europeo della ricerca Starting Grant (# 281306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
- Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
- Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).
- McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
- Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
- Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
- Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
- Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
- Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
- Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
- Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
