Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
Репликация генома происходит во время S-фазе клеточного цикла в сильно регулируемом процессе, который обеспечивает точность дублирования ДНК. Каждый геномная область реплицируется в отдельное время во время фазы S через одновременной активации нескольких начала репликации. Время репликации (ПКВ) коррелирует со многими геномных и эпигенетических особенностей и связан с частоты мутаций и рака. Осмысливая полную геномную вид программы репликации, в здоровье и болезни является одной из основных целей будущего и вызов.
В данной статье подробно описывается "Copy Number Коэффициент S / G1 для отображения геномную времени репликации" метод (в данном документе под названием: CNR-TOR), простой подход к карте генома широкий ToR клеток млекопитающих. Метод основан на количестве копий различий между S фазы клеток и фазы G1 клеток. Метод CNR-TOR выполняется в 6 этапов: 1. Подготовка клеток и окрашивание пропидиума йодида (PI); 2. Сортин G1 и фазы S клетки с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS); 3. Очистка ДНК; 4. Ультразвуком; 5. Подготовка библиотеки и последовательности; и 6. Биоинформатический анализ. Метод CNR-TOR является быстрый и простой подход, который приводит к репликации подробных карт.
Introduction
Млекопитающим репликации ДНК жестко регулируется, чтобы обеспечить точную репликацию каждой хромосомы только один раз в течение клеточного цикла. Репликация происходит в соответствии с жестко регламентированной порядке – несколько больших геномных областей (~ Мб) реплицировать в начале фазы S (начало репликации доменов) , тогда как другие геномные области репликации позже в средней или поздней фазе S (средние и поздние реплицирующихся доменов) 1. Большая часть генома реплицируются в то же время во всех тканях (конститутивные домены ПКВ), в то время как 30% – 50% генома, меняет свое техническое задание между тканями 2, во время дифференцировки 3, 4 , и в меньшей степени , также во время раковой трансформации 5 , Кроме того, некоторые геномные области репликации в асинхронном режиме 6, 7, 8, а именно есть разницав ПКВ между двумя аллелями.
ToR коррелирует со многими геномных и эпигеномном функций , включая уровни транскрипции, содержание GC, хроматина состояние, плотность генов и т.д. 1, 9. ToR также связан с частоты мутаций и типов 10, 11 и , следовательно , неудивительно, что возмущения программы репликации связаны с раком 12, 13. Причинно-следственная связь между ПКВ и структуры хроматина пока не понял. Вполне возможно, что открытая хроматина способствует раннему репликации. Тем не менее, альтернативная модель предполагает , что хроматин собирается во время репликации и различные регуляторы хроматина , присутствующие в начале и в конце S фазы приводят к дифференциальной упаковки ранних и поздних воспроизводящихся областей 1, 14 </sup>. Недавно мы показали , что формирует техническое задание содержание GC, влияя на тип мутаций , которые происходят в различных геномных областей 11.
Флуоресцентная гибридизация (FISH) в основной метод для измерения ПКВ на отдельных локусов. Она осуществляется просто путем подсчета процента клеток фазы S , которые обладают одной рыбы сигналы vs. процент дублетов для заданного аллель 15, 16. Альтернативный способ, состоит из последовательностей импульсов мечения ДНК , с помощью BrdU, сортировка клеток в соответствии с их содержанием ДНК в различные моменты времени по S, иммунопреципитации ДНК , содержащей BrdU, и проверять обилие осажденной ДНК с кПЦР 17.
Геномные отображение ТЗ может быть достигнуто двумя способами. Первый способ представляет собой геномную вариант метода, основанного BrdU-IP описанный выше, в котором количественное определение суммыосажденной ДНК в каждой фракции осуществляется одновременно в течение всего генома путем гибридизации с микрочипов или глубокой последовательности. Второй метод, CNR-ToR, основан на измерении числа копий каждой геномной области фазовых клеток S и нормализацию по содержанию ДНК в G1 клетках. В этом способе клетки сортируются по FACS в не-тиражирование (G1 фаза) и тиражирование (фаза S) группы (рисунок 1). Клетки в G1 имеют один и тот же номер копии всех геномных областей и, следовательно, их содержание ДНК должно быть одинаковым. С другой стороны, ДНК, число копий в S зависит от технического задания, так как ранние регионы Дублирование подверглись репликации в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК удваивается, в то время как поздние регионы Дублирование еще не реплицируются в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК будет быть похож на G1 клеток. Следовательно, S соотношение G1 содержания ДНК свидетельствует о ПКВ. Количество ДНК для каждой области генома измеряется либо путем гибридизациимикрочипов или глубокой последовательности 2, 8. будут дополнительно обсуждены преимущества метода CNR-TOR.
В данной статье описывается метод CNR-TOR для геномного картирования ToR , как описано на рисунке 2. В статье рассматриваются мелкие детали всего процесса от момента сбора клеток до базового анализа результатов и создания геномных ToR карт. Протокол, описанный в этой статье была успешно выполнена на различных типах клеток, выращенных в культуре. Дальнейшее совершенствование этого протокола может привести к отображению ПКВ в естественных условиях и в редких типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-TOR может быть выполнена в принципе на любой эукариотической популяции пролиферирующих клеток , которые могут быть разделены на FACS к S и G1 фазы (обзор Ринда Н. и Гилберта DM 20). Метод, описанный здесь, был скорректирован к клеткам млекопитающих с размером генома ~ 3 Gb, таких как …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим ория Варди за помощь в создании фигуры. Работа в группе была поддержана Израильского научного фонда (грант № 567/10) и Европейского исследовательского совета Начиная Грант (# 281306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
- Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
- Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).
- McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
- Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
- Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
- Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
- Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
- Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
- Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
- Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
