Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
A replicação do genoma ocorre durante a fase S do ciclo celular em um processo altamente regulado que assegura a fidelidade de duplicação de ADN. Cada região genómico é replicada em um momento diferente durante a fase S através da activação simultânea de múltiplas origens de replicação. Tempo de replicação (ToR) correlaciona-se com muitas características genômicas e epigenéticos e está ligada a taxas de mutação e câncer. Compreender o ponto de vista genômica completa do programa de replicação, na saúde e na doença é uma importante meta para o futuro e desafio.
Este artigo descreve em detalhes o "Número Taxa de cópia de S / G1 para mapear Tempo genômico de replicação" método (aqui chamado: CNR-ToR), uma abordagem simples para mapear o genoma ampla ToR de células de mamíferos. O método baseia-se nas diferenças no número de cópias entre as células em fase S e células em fase G1. O método CNR-TdR é realizado em 6 passos: 1. Preparação de células e a coloração com iodeto de propídio (PI); 2. SorTing G1 e células em fase S utilizando células activadas por fluorescência (FACS); 3. purificação de ADN; 4. sonicação; 5. preparação e sequenciamento da biblioteca; e 6. A análise bioinformática. O método CNR-Tor é uma abordagem fácil e rápido que resulta em mapas de replicação detalhadas.
Introduction
replicação de ADN de mamífero é estritamente regulada para assegurar a replicação precisa de cada cromossoma apenas uma vez durante o ciclo celular. A replicação ocorre de acordo com uma ordem altamente regulado – várias regiões genômicas grandes (~ Mb) replicar no início da fase S (início de replicar domínios), enquanto que outras regiões genômicas replicar mais tarde em (domínios médio e replicar tarde) médio ou fase S tardia 1. A maior parte do genoma replica ao mesmo tempo em todos os tecidos (domínios ToR constitutivos), enquanto que 30% – 50% do genoma, muda a sua TdR entre tecidos 2, durante a diferenciação 3, 4 e, em menor medida, também durante a transformação do cancro 5 . Além disso, certas regiões genómicas replicar de forma assíncrona 6, 7, 8, ou seja, existe uma diferençana especificação técnica entre os dois alelos.
ToR correlaciona com muitas características genômicas e epigenômicos incluindo os níveis de transcrição, conteúdo GC, estado de cromatina, a densidade gene, etc. 1, 9. Tor também está associada a taxas de mutação e tipos 10, 11 e, portanto, sem surpresa, perturbações do programa de replicação estão ligados ao câncer 12, 13. A relação causal entre ToR e estrutura da cromatina ainda não é compreendido. É possível que a cromatina aberta facilita a replicação inicial. No entanto, um modelo alternativo sugere que a cromatina é montada durante a replicação e os diferentes reguladores da cromatina presentes no início e no fim do avanço de fase S para embalagem diferencial de regiões de replicação precoce e tardio 1, 14 </sup>. Mostrámos recentemente que o TdR molda o teor de GC ao afectar o tipo de mutações que ocorrem em diferentes regiões genómicas 11.
Hibridização fluorescente in situ (FISH) é o método principal para a medição TdR em loci individuais. Ela é realizada simplesmente por meio da contagem da percentagem de células em fase S que exibem sinais de FISH individuais contra a percentagem de dupletos para um determinado alelo 15, 16. Um método alternativo, é constituído por impulsos marcação do ADN com BrdU, as células de apartação de acordo com o seu conteúdo em ADN para vários pontos de tempo ao longo S, imunoprecipitação ADN contendo BrdU, e verificando a abundância de ADN precipitado com 17 qPCR.
TdR mapeamento genómico pode ser alcançada através de dois métodos. O primeiro método é uma versão genómica do método baseado em IP BrdU descrito acima, em que a quantificação da quantidadede ADN foi precipitado em cada fracção é feito, simultaneamente, para a totalidade do genoma por meio de hibridação com micromatrizes ou por sequenciação de profundidade. O segundo método, CNR-TdR, baseia-se na medição do número de cópias de cada região genómica de células em fase S e normalizando pelo conteúdo em ADN em células G1. Neste método, as células são classificadas por FACS em não-replicante (fase G1) e replicação (fase S) grupos (Figura 1). As células em G1 tem o mesmo número de cópias em todas as regiões genómicas e, assim, o seu conteúdo de ADN deve ser o mesmo. Por outro lado, o número de cópias de ADN em S depende da TdR, uma vez que regiões replicadoras iniciais foram submetidos a replicação na maioria das células e, por conseguinte, o seu conteúdo de ADN é duplicada, enquanto que as regiões de replicação final ainda não replicado na maioria das células e, por conseguinte, o seu conteúdo de ADN serão ser semelhante ao de células G1. Daí a S à relação de G1 de conteúdo de DNA é indicativo do ToR. A quantidade de ADN para cada região genómica é medido quer por hibridação commicroarrays ou por uma profunda sequenciamento 2, 8. As vantagens do método CNR-TdR será discutido.
Este artigo descreve o método CNR-ToR para mapeamento genômico ToR como descrito na Figura 2. O artigo discute os detalhes de todo o processo a partir de células coleta até a análise básica dos resultados ea criação de mapas ToR genômicos. O protocolo descrito no presente trabalho foi realizado com sucesso em vários tipos de células cultivadas em cultura. Futuras melhorias deste protocolo pode levar ao mapeamento dos TdR in vivo e em tipos de células raras.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-TdR pode ser realizado, em princípio, em qualquer população de células em proliferação eucariótica que pode ser dividida por FACS para fases G1 e S (revisto por Rhind N. e Gilbert 20 DM). O método aqui descrito foi adaptado para células de mamífero com um tamanho de genoma de ~ 3 Gb, tais como humano e de ratinho. Pequenas mudanças no protocolo CNR-ToR (em preparação celular e profundidade sequenciamento) são necessários, a fim de ajustá-lo para outros eucariotas. Deve ser dad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Oriya Vardi de assistência na geração de números. Trabalho no grupo IS foi apoiado pelo Israel Science Foundation (concessão No. 567/10) e do Conselho Europeu de Investigação Começando Grant (# 281306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
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