تطور ال<em> ميتاريزيوم أنيسوبلياي</em> باعتباره ميكوسكتيسيد: من العزلة إلى الأداء الميداني
Summary
هنا، نحن نذكر المراحل المختلفة التي تنطوي عليها التنمية القائمة على المعرفة من ميكروسيكتيسيد فعالة، بما في ذلك العزلة وتحديد وفحص واختيار "الأنسب" الفطريات الممرضة للحشرات، ميتارهيزيوم أنيسوبلياي ، للسيطرة على الآفات الحشرية في الزراعة .
Abstract
وهناك قلق كبير عند تطوير ميكوسينتكتيديسيدس التجارية هو سرعة قتل مقارنة مع المبيدات الكيميائية. لذلك، العزلة والفحص لاختيار سريع المفعول، الفطريات حشرات شديدة الفطريات هي خطوات هامة. الفطريات الممرضة، مثل ميتارهيزيوم، بوفيريا، و نوموريا ، التي تعمل عن طريق الاتصال، هي أكثر ملاءمة من عصيات ثورينجينزيس أو نوكليوبوليهيدروسيس فيروس (نبف)، والتي يجب تناولها من قبل الآفات الحشرية. في هذا العمل، عزلنا 68 سلالة ميتارهيزيوم من الحشرات المصابة باستخدام طريقة تخفيف التربة والطعم. تم التعرف على العزلات عن طريق التضخيم وتسلسل المنطقة ITS1-5.8S-ITS2 و 26S ردينا. تم اختيار السلالة الأكثر شراسة من ميترهيزيوم أنيسوبلياي استنادا إلى تركيز قاتلة متوسط (لك 50 ) والوقت (لوت 50 ) التي تم الحصول عليها في الاختبارات البيولوجية الحشرات ضد يرقات إي-إنستار هيليكوفيربا أرميجيرا.وقد تم الإنتاج الضخم من الأبواغ من سلالة مختارة مع التخمير الحالة الصلبة (سف) باستخدام الأرز كركيزة لمدة 14 يوما. تم استخراج الجراثيم من الكتلة الحيوية المتناثرة باستخدام 0.1٪ توين-80، وتم تحضير تركيبات مختلفة من الجراثيم. أجريت تجارب ميدانية للصيغ من أجل السيطرة على إصابة H. أرميجيرا في البازلاء الحمامة بواسطة تصميم العشوائية. وكانت مستويات السيطرة على العدوى التي تم الحصول عليها بالزيت والتركيبات المائية (78.0٪ و 70.9٪ على التوالي) أفضل من 63.4٪ التي تم الحصول عليها بالمبيدات الكيميائية.
Introduction
ومنذ إدخال مبيدات الآفات العضوية الكلورية في الأربعينات في الهند، زاد استخدام مبيدات الآفات بأكثر من 1 أضعاف، حيث لا تزال آفات المحاصيل تكلف بلايين الروبية 2 سنويا من حيث خسارة الغلة في الإنتاج الزراعي. ويشكل الاستخدام الواسع النطاق وغير الحكيم للمبيدات الاصطناعية تهديدا مستمرا للبيئة وصحة الإنسان 1 . ويؤدي الاستخدام العشوائي لمبيدات الآفات إلى بقايا التربة واستنزاف الحيوانات المفترسة للآفات. كما أنه بمثابة ضغط اختيار قوي لتغيير التركيب الجيني من السكان الآفات، مما يؤدي إلى تطوير المقاومة 1 . وعلى الرغم من الفوائد الهائلة للثورة الخضراء، التي تتطلب مدخلات عالية، مثل الأسمدة ومبيدات الآفات، لا تزال الآفات تشكل قيدا حيويا رئيسيا. وهناك تقدير عام للخسائر السنوية المسجلة في المحاصيل في الهند وفي جميع أنحاء العالم يبلغ 12 مليار دولار أمريكيإف "> 2 و 2،000 مليار دولار أمريكي 3 ، على التوالي.
وعندما تكون للمبيدات الكيميائية آثار ضارة عند استخدامها لمكافحة الآفات الحشرية، يصبح من الضروري البحث عن طرق بديلة سليمة بيئيا وموثوق بها واقتصادية ومستدامة. وتوفر المكافحة البيولوجية بديلا مناسبا وتشمل استخدام الطفيليات والحيوانات المفترسة ومسببات الأمراض الميكروبية 4 . الفطريات، على سبيل المثال، من المعروف أنها تصيب مجموعة واسعة من الآفات الحشرية، بما في ذلك ليبيدوبتيرانز، هيمينوبتيرانز، كولوبتيرانز، و ديبتيرانز، وغالبا ما يؤدي إلى إبيزوتيكس الطبيعية. وعلاوة على ذلك، على عكس عوامل مكافحة الحشرات البكتيرية والفيروسية الأخرى، فإن طريقة عمل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية هي عن طريق الاتصال 5 . هذه الفطريات تتكون من مجموعة غير متجانسة من أكثر من 100 جنسا، مع ما يقرب من 750 الأنواع المبلغ عنها بين الحشرات المختلفة. مسببات الأمراض الفطرية مهمة هي: س متارهيزيوم، البوفيرية الصورةص، نومورايا ريلي ، ليكانيسيليوم ليكاني ، و هيرسوتيلا سب.، على سبيل المثال لا الحصر 6 . M. أنيسوبلياي (ميتشنيكوف) سوروكين هو ثاني أكثر الفطريات الممرضة للحشرات المستخدمة على نطاق واسع في المكافحة الحيوية. ومن المعروف أن مهاجمة أكثر من 200 نوعا من الحشرات 7 .
في هذه الدراسة، يتم عرض مراحل مختلفة تشارك في التنمية القائمة على المعرفة من ميكوبيستيد باستخدام M. أنيسوبلياي . وهذا يشمل: 1) تحديد مصدر ( أي التربة أو الحشرات الميكوسيد) لممرضات الحشرات الفطرية، 2) تحديد الممرضات واختيارها، 3) استراتيجيات للحفاظ على طبيعتها الفوعة وفعاليتها في الفحص الحيوي للمختبر وفي الميدان، 4 ) صياغة فعالة من حيث التكلفة من البكتيريا العدوى، 5) تطوير فريدة من نوعها لمراقبة الجودة المعلمات لإعداد فادحة، و 6) التنقيب البيولوجي وإضافة القيمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلال 1880s، وقد بذلت المحاولة الأولى لاستخدام ميتارهيزيوم للسيطرة على خنافس الخنفساء، أنيسوبليا أوسترياكا، وبنجر السكر كورك، كليونيس بونكتيفنتريس 21 . في هذا البروتوكول، كان واحدا من الشروط المسبقة لعزل سلالة فظيعة، سواء من التربة أو من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويقر المؤلفون بمساهمة المتعاونين من برنامج التعاون بين الهند وسويسرا في مجال التكنولوجيا الحيوية (إسب) التابع لإدارة التكنولوجيا الحيوية في نيودلهي والوكالة السويسرية للتنمية والتعاون في برن بسويسرا. ومن المسلم به مساهمات طلاب المشروع والموظفين المشاركين في تطوير ميكروسيكتيسيد، بما في ذلك فاندانا غورماد، بالافي نهار، بريا ياداف، شوكلانجي كولكارني، مانيشا كابور، سانتوش تشافان، رافيندرا فيدهات، شامالا ماني، و أبهيجيت لاند. إيكب و سغت شكر لجنة المنح الجامعية والهند ومجلس البحوث العلمية والصناعية (كسير)، الهند، على التوالي، للزمالات البحث. تعترف وزارة الدفاع والتنمية بدعم مجلس البحوث الصناعية والعلمية، نيودلهي لبرنامج العلماء الفخري. ويعرب المؤلفون عن امتنانهم لإدارة التكنولوجيا الحيوية في نيودلهي بالهند للدعم المالي المقدم في إطار برنامجي إسبب و سبيري. ونحن ممتنون لالمراجعين للمدخلات الخاصة بهم.
Materials
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G., Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. , 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A., Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. , 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., MV, D. e. s. h. p. a. n. d. e., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi – a valuable alternative to fight against insect pests. , 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E., Leathan, G. F. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. , 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D., Lacey, L. A. . Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. , 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Innis, M. A. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. , 315-322 (1990).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. . Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. . Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G., Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. , 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
