פיתוח של<em> מטריציום anisopliae</em> כמקוטלת חיידקים: מהבידוד לביצועי שדה
Summary
כאן אנו מדווחים על השלבים השונים המעורבים בפיתוח המבוסס על ידע של קוטל חיטוי יעיל, כולל הבידוד, הזיהוי, ההקרנה וההבחנה של הפטרייה האנטומופתוגנית ה"מתאימה ביותר ", Metarhium anisopliae , לשליטה על מזיקים לחרקים בחקלאות .
Abstract
החשש העיקרי בעת פיתוח mycoinsecticides מסחרי הוא מהירות להרוג לעומת זה של חומרי הדברה כימיים. לכן, בידוד והקרנה לבחירת פטרייה אנטומפטוגנית מהירה ופורחת, הם צעדים חשובים. פטריות אנטומופתוגניות, כגון Metarhium, Beauveria ו- Nomurea , אשר פועלות על ידי מגע, מתאימות יותר ל- Bacillus thuringiensis או ל- nucleopolyhedrosis (NPV), אשר יש לבלוע את הדברה. בעבודה הנוכחית, אנו מבודדים 68 זנים Metarhizium מ חרקים נגועים באמצעות דילול הקרקע שיטת הפיתיון. הבידוד זוהו על ידי הגברה ורצף של ה- ITS1-5.8S-ITS2 ו- 26S rDNA האזור. זן ארסי ביותר של metishizium anisopliae נבחר על בסיס ריכוז קטלני חציון (LC 50 ) ואת הזמן (LT 50 ) שהושגו bioassays חרק נגד III-instar הזחלים של Helicoverpa armigera.הייצור ההמוני של נבגים על ידי הזנים שנבחרו בוצע עם תסיסה במצב מוצק (SSF) באמצעות אורז כמצע במשך 14 ימים. נבגים הוצאו מן ביומסה ספורטיבית באמצעות 0.1% tween-80, ניסוחים שונים של נבגים הוכנו. ניסויים שדה של ניסוחים עבור שליטה של H. Armigera infestation ב יונים אפונה בוצעו על ידי בלוק אקראי העיצוב. רמות הבקרה של השד שהתקבלו עם שמן ותרכובות מימיות (78.0% ו -70.9%, בהתאמה) היו טובות יותר מאשר 63.4% שהושגו עם חומרי הדברה כימיים.
Introduction
מן ההקדמה של חומרי הדברה אורגנוכלורין ב 1940s בהודו, השימוש בחומרי הדברה גדל רבים לקפל 1 , עם מזיקים היבול עדיין עולה מיליארדי רופי 2 בשנה במונחים של אובדן התשואה בייצור החקלאי. השימוש הנרחב והלא-מושכל של חומרי הדברה סינתטיים הוא איום מתמשך על הסביבה ועל בריאות האדם 1. השימוש ללא הבחנה בחומרי הדברה מוביל לשאריות בקרקע ולדלדול של טורפים טבעיים. היא משמשת גם כבחירת לחץ חזקה לשינוי ההרכב הגנטי של אוכלוסיית הדברה, המוביל להתפתחות ההתנגדות 1 . למרות היתרונות העצומים של המהפכה הירוקה, שדרשה תשומות גבוהות, כמו דשנים וחומרי הדברה, המזיקים ממשיכים להיות אילוצים ביוטיים גדולים. אומדן כללי של ההפסדים השנתיים שנצברו בהודו ובעולם הוא 12 מיליארד דולרEf "> 2 ו -2,000 מיליארד דולר 3 , בהתאמה.
כאשר חומרי הדברה כימיים יש השפעות מזיקות כאשר נעשה שימוש כדי לשלוט מזיקים חרקים, זה הופך להיות הכרחי לחפש שיטות חלופיות כי הם מבחינה אקולוגית, אמין, חסכוני, בר קיימא. בקרה ביולוגית מציעה חלופה ראויה כוללת השימוש טפיל, טורפים, ופתוגנים מיקרוביאלי 4. פטריות, למשל, ידועים להדביק מגוון רחב של מזיקים חרקים, כולל lepidopterans, hymenopterans, coleopterans, דיפטרנים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך אפיזוטיקה טבעית. יתר על כן, שלא כמו סוכני בקרת חרקים ויראליים אחרים, מצב הפעולה של פטריות חרקים פתוגניים הוא על ידי מגע 5 . פטריות אלה מהווים קבוצה הטרוגנית של למעלה מ -100 סוגים, עם כ -750 מינים המדווחים בין חרקים שונים. הפתוגנים החשובים הם: Metarhizium sp., Beauveria sעמ ', Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii , ו Hirsutella sp., עד כמה שם 6 . M. Anisopliae (Metchnikoff) Sorokin הוא הפטרייה האנטומופתוגנית השנייה הנפוצה ביותר בביוקונטר. זה ידוע לתקוף מעל 200 מינים של חרקים 7 .
במחקר זה, שלבים שונים המעורבים בפיתוח מבוסס ידע של mycopesticide באמצעות M. anisopliae מוצגים. זה כולל: 1) זיהוי של מקור ( כלומר, אדמה או חרקים mycosed) עבור entomopathogens ארסיות, 2) זיהוי אנטומפטוגן ובחירה, 3) אסטרטגיות כדי לשמור על הטבע האלים שלהם ואת יעילות bioassay במעבדה בתחום, 4 ) ניסוח חסכוני של propagules זיהומיות, 5) פיתוח של פרמטרים ייחודיים בקרת איכות להכנה ארסית, ו 6) bioprospecting ותוספת ערך.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך 1880s, נעשה ניסיון ראשון להשתמש Metarhium כדי לשלוט חיפושית חרפושית, Anisoplia austriaca, ואת סלק סוכר curculio, Cleonis punctiventris 21 . בפרוטוקול זה, אחד התנאים המוקדמים היה לבודד זן ארסי, או מהקרקע או מחרקים נגועים. ואכן, פרמטרים אחרים, כגון LC 50 , LT 50</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על תרומתם של משתפי הפעולה של שיתוף הפעולה ההודו-שוויצרי בביוטכנולוגיה (ISCB) של המחלקה לביוטכנולוגיה, ניו דלהי והסוכנות השוויצרית לפיתוח ושיתוף פעולה, ברן, שוויץ. תרומתם של תלמידי הפרויקט והצוות המעורבים בפיתוח המיקוטין, כולל ונדנה גורמה, פלבי נהאר, פרייה ידב, שוקלנגי קולקרני, מנישה קאפור, סאנטוש שוואן, רבינדרה וידהאטה, שמאלה מאנה ואבהיג'יט לנדה. EKP ו SGT תודה ועדת מענקים האוניברסיטה, הודו המועצה המדעית והתעשייתית מחקר (CSIR), הודו, בהתאמה, עבור מלגות מחקר. MVD מודה על התמיכה של המועצה המדעית והמחקר המדעי, ניו דלהי עבור תוכנית המדען אמריטוס. המחברים מודים למחלקה לביוטכנולוגיה, ניו דלהי, הודו על התמיכה הכספית תחת ISCB ו SBIRI תוכניות. אנו אסירי תודהסוקרים עבור התשומות שלהם.
Materials
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G., Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. , 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A., Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. , 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., MV, D. e. s. h. p. a. n. d. e., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi – a valuable alternative to fight against insect pests. , 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E., Leathan, G. F. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. , 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D., Lacey, L. A. . Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. , 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Innis, M. A. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. , 315-322 (1990).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. . Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. . Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G., Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. , 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
