Desarrollo de<em> Metarhizium anisopliae</em> Como Mycoinsecticide: Del aislamiento al funcionamiento del campo
Summary
Aquí se presentan las diferentes etapas del desarrollo basado en el conocimiento de un micoinsecticida eficaz, incluyendo el aislamiento, la identificación, el cribado y la selección del hongo entomopatógeno "mejor ajustado", Metarhizium anisopliae , para el control de plagas de insectos en la agricultura .
Abstract
Una preocupación importante cuando se desarrollan los micoinsecticidas comerciales es la velocidad de matanza comparada con la de los insecticidas químicos. Por lo tanto, el aislamiento y el cribado para la selección de un hongo entomopatógeno altamente virulento de acción rápida son pasos importantes. Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium, Beauveria y Nomurea , que actúan por contacto, son más adecuados que el Bacillus thuringiensis o el virus de la nucleopoliedrosis (NPV), que debe ser ingerido por la plaga de insectos. En el presente trabajo, se aislaron 68 cepas de Metarhizium de insectos infectados utilizando un método de dilución y cebo. Los aislados fueron identificados por la amplificación y secuenciación de la ITS1-5.8S-ITS2 y 26S rDNA región. La cepa más virulenta de Metarhizium anisopliae se seleccionó en base a la concentración letal media (LC 50 ) y el tiempo (LT 50 ) obtenido en bioensayos de insectos contra larvas de larvas de III-instar de Helicoverpa armigera.La producción en masa de esporas por la cepa seleccionada se llevó a cabo con fermentación en estado sólido (SSF) utilizando arroz como sustrato durante 14 días. Se extrajeron esporas de la biomasa esporulada utilizando tween-80 al 0,1%, y se prepararon diferentes formulaciones de las esporas. Los ensayos de campo de las formulaciones para el control de una infestación por H. armigera en garbanzos se realizaron mediante diseño de bloques al azar. Los niveles de control de infestación obtenidos con formulaciones oleosas y acuosas (78,0% y 70,9%, respectivamente) fueron mejores que el 63,4% obtenido con pesticida químico.
Introduction
Desde la introducción de los plaguicidas organoclorados en la década de 1940 en la India, el uso de plaguicidas ha aumentado muchas veces 1 , con plagas de cultivos que todavía cuestan billones de rupias 2 anualmente en términos de pérdida de rendimiento en la producción agrícola. El uso generalizado y no juicioso de plaguicidas sintéticos es una amenaza continua para el medio ambiente y la salud humana 1 . El uso indiscriminado de plaguicidas produce residuos en el suelo y el agotamiento de los depredadores naturales de plagas. También sirve como una potente presión de selección para alterar la composición genética de una población de plagas, lo que lleva al desarrollo de resistencia 1 . A pesar de los enormes beneficios de la revolución verde, que requiere insumos altos, como fertilizantes y pesticidas, las plagas siguen siendo una importante restricción biótica. Una estimación general de las pérdidas anuales de cultivos registradas en la India y en todo el mundo es de USD 12.000 millonesEf "> 2 y 2.000 millones de dólares 3 , respectivamente.
Cuando los plaguicidas químicos tienen efectos perjudiciales cuando se usan para controlar plagas de insectos, se hace imprescindible buscar métodos alternativos que sean ecológicamente sanos, confiables, económicos y sostenibles. El control biológico ofrece una alternativa adecuada e incluye el uso de parásitos, depredadores y patógenos microbianos 4 . Los hongos, por ejemplo, son conocidos por infectar una amplia gama de plagas de insectos, incluyendo lepidópteros, himenópteros, coleópteros y dipteranos, resultando a menudo en epizootias naturales. Además, a diferencia de otros agentes de control de insectos bacterianos y virales, el modo de acción de hongos patógenos de insectos es por contacto 5 . Estos hongos comprenden un grupo heterogéneo de más de 100 géneros, con aproximadamente 750 especies reportadas entre diferentes insectos. Los patógenos fungosos más importantes son: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii y Hirsutella sp., Por nombrar algunos 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin es el segundo hongo entomopatógeno más utilizado en biocontrol. Se sabe que ataca a más de 200 especies de insectos [ 7] .
En este estudio, se presentan diferentes etapas involucradas en el desarrollo basado en el conocimiento de un mycopesticide usando M. anisopliae . 2) identificación y selección de entomopatógenos, 3) estrategias para mantener su naturaleza virulenta y su efectividad en el bioensayo de laboratorio y en el campo, 4) identificación de una fuente ( es decir, insectos micosos o de suelo) para entomopatógenos virulentos; ) La formulación rentable de propágulos infecciosos, 5) el desarrollo de parámetros únicos de control de calidad para la preparación virulenta, y 6) la bioprospección y la adición de valor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la década de 1880, se hizo el primer intento de utilizar Metarhizium para controlar el escarabajo del escarabajo, Anisoplia austriaca, y el curculio de la remolacha azucarera, Cleonis punctiventris 21 . En este protocolo, uno de los prerrequisitos fue aislar una cepa virulenta, ya sea del suelo o de insectos infectados. De hecho, otros parámetros, como LC 50 , LT 50 y ST 50 , contribuyeron significativamente a la rentabil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la contribución de los colaboradores del programa de Colaboración Indo-Suiza en Biotecnología (ISCB) del Departamento de Biotecnología de Nueva Delhi y de la Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación, Berna, Suiza. Se reconoce la contribución de los estudiantes del proyecto y del personal involucrado en el desarrollo del micoinsecticida, incluyendo a Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane y Abhijeet Lande. EKP y SGT agradecen a la University Grants Commission, India y al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), India, respectivamente, por becas de investigación. MVD reconoce el apoyo del Consejo de Investigación Industrial y Científica, Nueva Delhi para el Emeritus Scientist Scheme. Los autores agradecen al Departamento de Biotecnología, Nueva Delhi, India, por el apoyo financiero de los programas ISCB y SBIRI. Estamos agradecidos aRevisores por sus aportaciones.
Materials
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G., Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. , 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A., Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. , 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., MV, D. e. s. h. p. a. n. d. e., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi – a valuable alternative to fight against insect pests. , 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E., Leathan, G. F. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. , 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D., Lacey, L. A. . Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. , 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Innis, M. A. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. , 315-322 (1990).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. . Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. . Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G., Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. , 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
