تم إنشاء اثنين من خوارزميات تحليل الصور، "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics"، لتحديد تسعة الميزات المورفولوجية للذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) تلقائيا.
مورفولوجيا متشابك يرتبط ارتباطا وثيقا فعالية متشابك، وفي كثير من الحالات العيوب الشكلية المشبك تؤدي في نهاية المطاف إلى خلل متشابك. ذبابة الفاكهة اليرقات الوصل العصبي العضلي (NMJ)، وهذا نموذج راسخة لنقاط الاشتباك العصبي glutamatergic، وقد درس على نطاق واسع على مدى عقود. تحديد الطفرات المسببة العيوب الشكلية NMJ كشفت عن وجود ذخيرة من الجينات التي تنظم وضع المشبك وظيفة. وقد تم تحديد العديد من هذه الدراسات على نطاق واسع أن تركز على النهج النوعية للكشف عن تشوهات شكلية من ذبابة الفاكهة NMJ. والعيب من التحليلات النوعية هو أن العديد من اللاعبين خفية المساهمة في التشكل NMJ المرجح أن تظل دون أن يلاحظها أحد. في حين يطلب من التحليلات الكمية للكشف عن الاختلافات الشكلية دهاء، هذه التحليلات ليست بعد أداء عادة لأنها شاقة. يصف هذا البروتوكول في التفاصيل اثنين من خوارزميات تحليل الصور "ذبابة الفاكهة </em> NMJ Morphometrics "و" ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics "، كما تتوفر وحدات الماكرو فيجي المتوافقة، لتحليل المورفومترية الكمي ودقيق وموضوعي لذبابة الفاكهة NMJ. تم تطوير هذه المنهجية لتحليل المحطات NMJ immunolabeled مع علامات تستخدم عادة أجهزة … (1) و . BRP بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم تطبيقها على نطاق أوسع لعلامات أخرى مثل برنامج الصحة الإنجابية، CSP وSYT في هذا البروتوكول وحدات الماكرو قادرة على تقييم تسعة ميزات NMJ المورفولوجية: منطقة NMJ، محيط NMJ، وعدد من حبات، طول NMJ، NMJ أطول فرع طول، وعدد من الجزر، وعدد الأفرع، وعدد من المتفرعة نقاط وعدد من المناطق النشطة في محطة NMJ.
الاضطرابات المعرفية مثل الإعاقة الذهنية، واضطراب طيف التوحد والفصام غالبا ما تتميز اختلال وظيفة متشابك 1، 2، 3. مورفولوجيا المشبك وظيفة تتشابك بإحكام. عيوب شكلية يمكن أن يسبب خلل متشابك و، باتجاهين معاكسين، وانتقال متشابك الشاذة يؤثر نضوج متشابك والتشكل 4 و 5 و 6.
وقد تم استخدام عدد من الكائنات النموذج من أجل فهم أفضل لبيولوجيا المشبك وتسليط الضوء على كيفية تأثير التغييرات متشابك وظيفة الدماغ في الصحة والمرض 7 و 8 و 9. هو درس ذبابة الفاكهة NMJ على نطاق واسع وراسخة في نموذج الجسم الحي للسي glutamatergicعلم الأحياء 10 و 11 napse. في العقود الماضية، وقد استخدم هذا النموذج للدراسات الفسيولوجية والتي تركز على الجينات، وكذلك لشاشات الوراثية على نطاق واسع، وذلك بهدف الكشف عن الاختلافات الشكلية بين لل NMJs. على وجه الخصوص، وقد حددت شاشات الوراثية إلى الأمام العديد من الجهات التنظيمية وآليات حاسمة الكامنة وراء تطور المشبك وتعمل 12 و 13 و 14 و 15 و 16. ومع ذلك، فإن معظم هذه الشاشات تعتمد على التقييم البصري للNMJ التشكل المحطة وعلى الكشف النوعي للتشوهات متشابك أو تسجيل نصف الكمية من عدد قليل من السمات المورفولوجية. ونتيجة لذلك، خفية بدلا تشوهات شكلية متشابك التي هي غير واضحة للعين البشرية وغاب بسهولة. من أجل أن تكون قادرة على كشف شامل الاختلافات الكمية، ولديها NMJ التي سيتم تقييمها بدقة من خلال تقدير المنتظم للمعلمات المورفولوجية للاهتمام. قياس ملامح NMJ يدويا هي شاقة، خاصة عند وجود العديد من الميزات NMJ الفائدة و / أو عند إجراء الفحوصات الجينية على نطاق واسع. من أجل دعم multiparametric، الإنتاجية العالية التحليل الصرفي وتحقيق تقدير موضوعي، وقد وضعت اثنين من وحدات الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" 17. تشغيل كل من وحدات الماكرو في البرمجيات مفتوحة المصدر تحليل الصور فيجي 18، ويمكن تحديد كل من الصور مبائر وnonconfocal.
"ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" تدابير محطات NMJ immunostained مع علامة القرص بعد المشبكي واسع 1 (DLG-1) أو قبل المشبكي الفجل البيروكسيديز (HRP)، وشارك في المسمى مع نشطة bruchpilot علامة منطقة (بدر). ومن الكمي تسعة parame الصرفيالنسب (مزيد موضح أدناه): منطقة NMJ، محيط NMJ، وعدد من حبات، طول NMJ، NMJ أطول طول فرع، وعدد من الجزر، وعدد الأفرع، وعدد من المتفرعة نقاط وعدد من المناطق النشطة في محطة متشابك (الشكل 1) . على الرغم من خوارزمية لتحديد عدد من حبات موجودة في هذا الماكرو، فإنه لم تستوف معايير دقة 17. لتقييم صحيح عدد حبات، فمن الضروري استخدام "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" ماكرو، الذي تم تصميمه خصيصا لقياس حبات استخدام مستحضرات NMJ immunostained بواسطة anti-Synaptotagmin (SYT) أو البروتين سلسلة مكافحة السيستين (CSP)، وشارك في immunolabeled مع بدر. الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" يقيس المعلمات التالية: عدد حبات، NMJ منطقة حبة، طول NMJ، NMJ أطول طول فرع، وعدد من الجزر، وعدد الأفرع، وعدد من نقاط المتفرعة وعدد من زوي نشطالأخبار (الشكل 2).
وحدات الماكرو تتكون من وحدات الماكرو دون 3: (I) "تحويل إلى كومة" يحدد جميع ملفات الصور المتاحة ويخلق Z-hyperstacks والحد الأقصى لتقديرات كثافة كل من القنوات. كما تم إخراجه، وهذا الماكرو توليد ملفين جديدة في المشبك يسمى "stack_image_name" و "flatstack_image_name". II) "تعريف ROI" ستفتح كل القصوى الصور إسقاط "flatstack_image_name" على التوالي وتقديمها مع طلب لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي محطة متشابك محددة من الفائدة الحالية يدويا. وقد تم تنفيذ هذا للسماح استبعاد نقاط الاشتباك العصبي التي تربط العضلات المجاورة و / أو أنواع أخرى من محطات متشابك (مثل 1S) التي يمكن أن تكون موجودة في الصور 11. (III) "تحليل" ينطبق مؤتمتة بالكامل التحليل لجميع المناطق من الصور داخل حدود العائد على الاستثمار. مثلنتيجة لهذه الخطوة، سيكون المستخدم الحصول على ملفين جديدة: "RESULTS.TXT" حيث سيتم المشروح كل قياس العددي و"res_image_name.tif" حيث سيتم توضيح لتقطيع الصورة الكامنة التي تنتجها الماكرو. خلال تحليل الصور وتستمد ثلاثة مبان من كل محطة متشابك: الخطوط العريضة NMJ، والهيكل العظمي NMJ، وعدد من المناطق النشطة بدر إيجابية. يستخدم مخطط NMJ لتحديد منطقة NMJ ومحيطها ويقدم الفصل فاصلا لاحق عدد من حبات. من الهيكل العظمي، تم استنتاج خمس ميزات NMJ: الطول الكلي NMJ، مجموع طول أطول مسار مستمر توصيل أي نقاط نهاية اثنين (أطول طول فرع)، وعدد حجرات غير مترابطة في NMJ (المشار إليها باسم "الجزر" )، وعدد من الفروع، وعدد من النقاط المتفرعة (نقطة التفرع واحد يربط ثلاثة أو أكثر من الفروع). يتم تحديد عدد من المناطق النشطة في قناة بدر عن طريق عدالبقع بدر إيجابية. يتم عرض المخطط التفصيلي NMJ (الخط الأصفر)، والهيكل العظمي NMJ (الخط الأزرق)، وعدد من المناطق النشطة بدر إيجابية (المشار إليها البؤر الأبيض) في صورة النتائج وتتم معالجة قياسات المعلمات إلى (. النص) ملف الإخراج (الشكل 3).
ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics "و" ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics "وصفت لأول مرة والتحقق من صحتها على نطاق واسع من قبل Nijhof وآخرون. 17. وتركز هذه المخطوطة على منهجية لتحليل NMJ التشكل باستخدام وحدات الماكرو" ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics "و" ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics ". ومع ذلك، قبل أن التحليلات الكلية بمساعدة، تحتاج تشريح NMJ وimmunostainings التي يتعين القيام بها. وهذه خطوات حاسمة، والجمع بين علامات تستخدم لالمناعية يجب أن يكون مناسبة لتحليل الاقتصاد الكلي. وردت هذه الخطوات لفترة وجيزة في حد ذاتهاction 1 من هذا البروتوكول وتوجيه المستخدم إلى المراجع التي تصف بالتفصيل بروتوكولات لتنفيذ هذه الإجراءات.
"ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ حبة Morphometrics" هي أدوات قوية للباحثين المهتمين في تقييم المشبك التشكل. تقييم اليدوي للمعلمات NMJ هو شاقة. وتشير التقديرات إلى أن وحدات الماكرو من شأنه أن ينقذ باحث خبرة تصل إلى 15 دقيقة / قضى NMJ على الخط تقطيع الصورة. مع 1:59 العشرات من نقاط الاشتباك العصبي تقييم لكل حالة أو التركيب الوراثي، وهذا يلخص بسرعة تصل إلى كميات كبيرة من الوقت الذي يمكن توفيره، حتى في الدراسات الصغيرة. عند تنفيذ شاشات كبيرة، كسب باستخدام تحليل إنتاجية عالية، مقارنة تقييم اليدوي وتقدير، يمكن أن يكون هائلا. بالإضافة إلى زيادة الإنتاجية، وحدات الماكرو توفر بسهولة التحليل الموضوعي. أنها تستبعد التحيزات الشخصية التي تتطلب خلاف ذلك التجارب أعمى فضلا عن الخلافات الشخصية التي تحدث عندما يشارك الباحثون متعددة في التحليل. وأخيرا، توفر وحدات الماكرو لوحساسة ودقيقةalysis من الميزات NMJ، مما يسمح بتحديد هوية المنظمين متشابك التي تسبب خفية بدلا من العيوب NMJ مثيرة وظلت حتى الآن غير مقدر بالعين الباحث. تم العثور على معلومات مفصلة حول إجراءات التحقق من صحة وخوارزميات المستخدمة في وحدات الماكرو في نشر Nijhof وآخرون. 17.
تم التحقق من صحة وظيفة من وحدات الماكرو لقياس بشكل مناسب الميزات المورفولوجية من ذبابة الفاكهة لل NMJs في العضلات 4. وفي وقت لاحق، وقد تبين أن وحدات الماكرو وكانت أيضا مناسبة لتحليل نقاط الاشتباك العصبي في العضلات الأخرى في هذا الحي. ومن المرجح أن وحدات الماكرو يمكن أن تستخدم أيضا لقياس المعلمات المورفولوجية للNMJ مع هيكل مماثل في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الأنواع ذبابة الفاكهة الأخرى ومزيد من الحشرات. حتى لل NMJs بعيدة جدا في التطور، على سبيل المثال، لل NMJs من الفئران، وتبين التشكل الهيكلي مماثلة تماما 29. لم يتم اختبارها وحدات الماكرو على الاستعدادات NMJ من الأنواع الأخرى ولكن يتم تشجيع المستخدمين المحتملين لاختبار وحدات الماكرو لمثل هذه الأغراض.
من المهم جدا أن المستخدم يستكشف مختلفة لصناعة السيارات في العتبات وخوارزميات لتحديد / اختيار إعدادات الماكرو أكثر ملائمة للصور. مع هذه الإعدادات، ويتحقق بدقة ما يقرب من 95٪ عند مقارنة تقييم الكلي للتقييم اليدوي. ضبط إعدادات الماكرو بشكل صحيح الشريحة 100٪ من الصور يمكن أن يكون الإجراء شاقة للغاية أو حتى من المستحيل. لذلك، فمن المستحسن استبعاد الصور لا مجزأة بشكل صحيح إذا أعدادهم أقل من 5٪. من الواضح، إذا كانت جودة الصور منخفضة، فإن وحدات الماكرو توليد نسب أعلى من تقطيع الصورة غير المرضية. وصور ذات جودة منخفضة تؤثر بالمثل تقييم اليدوي وبالتالي لا يمكن ربطها أداء وحدات الماكرو. ومع ذلك كانت وحدات الماكرو قوية بدلا لأنها كانت مصممة للصورةق إنشاؤها على المجهر المحتوى العالي (المجهر مضان الآلية التي تسمح التصوير أعداد كبيرة من عينات) 17.
وهناك نقطة هامة هي أن المستخدم يتفقد بصريا جميع الصور نتيجة الناتجة عن وحدات الماكرو. وهذا سوف يسمح لكشف واستبعاد الصور مع تجزئة غير مرضية. في المادة 6 من هذا البروتوكول، ويسترشد المستخدم كيفية ضبط إعدادات تجزئة الصورة الصحيحة عند تشغيل الكلي الفرعي "تحليل". للتعرف بسرعة مع متطلبات وحدات الماكرو وكيفية ضبط إعدادات الماكرو مجلد يسمى "Examples_adjusting إعدادات الماكرو" يتم تضمينها في https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a مستودع الماكرو. ، وتقدم ثلاثة عشر المجلدات الفرعية، ولكل منها أمثلة الصور التي تم الحصول عليها في منصات المجهر مختلفة (المجاهر نسبة عالية / متحد / مضان) وimmunostainings مختلفة. يتم تضمين PDF بعنوان "دليل أمثلة" في نفسالمجلد حيث يتم توفير الإعدادات المطلوبة لكل سبيل المثال، جنبا إلى جنب مع وثيقة نصية تقديم النتائج المتوقعة والنتائج الصور.
تم تصميم وحدات الماكرو لمعالجة الصور المحفوظة كما و tiff فصل الملفات، ومع ذلك بعض المستخدمين قد حفظ الصور في شكل مختلف. موقع https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 التالية يحتوي على مجلد باسم "ذبابة الفاكهة NMJ" حيث ثلاثة ملفات سبيل المثال (مثال 1-3) و "دليل أمثلة" وثيقة مع تعليمات مفصلة كيفية استيراد الصور إلى الماكرو إذا لم يتم تخزين كما و tiff فصل الملفات يمكن أيضا أن تكون موجودة في نفس المجلد.
معا "، وذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ حبة Morphometrics" وحدات الماكرو تحديد عشرة مختلفة ميزات NMJ: منطقة NMJ، محيط NMJ، وعدد من حبات، منطقة حبة NMJ، طول NMJ، NMJ أطول طول الفرع وعدد جزيرةإدارة الأمن الوطني، وعدد من الفروع، وعدد من النقاط المتفرعة وعدد من المناطق النشطة. وهذا يوفر ميزة كبيرة على الأدوات بحيث المتاحة الآن التي يمكن تقييم واحد فقط أو عدد قليل من السمات متشابك 30 و 31. التحليل الكمي Multiparametric يحمل إمكانات كبيرة لاكتشافات جديدة، على سبيل المثال، لتحديد المنظمين الرواية التي تتحكم في واحدة تصل إلى جوانب عديدة من الأحياء المشبك. كما يوفر القرار اللازم لتحديد الجينات التي coregulate بالضبط نفس أو متداخلة ميزات NMJ وبالتالي من المحتمل أن تعمل في المسارات الجزيئية المشتركة. وأخيرا، فإنه يفتح إمكانية للتحقيق في مدى اختلاف ترتبط المعلمات متشابك مع بعضها البعض في ظروف دون عائق 17 و الجينات التي تضمن تلك الارتباطات المورفولوجية منسقة.
أخذت معا، ويوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام وحدات الماكرو اثنين "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و"ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics"، والتي تؤدي تقدير موضوعي وحساسة من عشرة صفات NMJ المورفولوجية بطريقة عالية الإنتاجية.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف مركز الاسهم مركز الموارد ذبابة الفاكهة فيينا وبلومينغتون ذبابة الفاكهة (NIH P40OD018537) لتوفير سلالات ذبابة الفاكهة. نشكر جاك فرانسين من مركز التصوير الميكروسكوبية لدعم الخبراء في مجال التصوير. وأيد هذه الدراسة من قبل فيدي والمنح TOP (917-96-346، 912-12-109) من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO)، من قبل اثنين زمالات الدكتوراه المركز الطبي DCN / جامعة رادبود، من قبل العقلية شبكة التخلف الألمانية بتمويل من برنامج NGFN + من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF) وGencodys الاتحاد الأوروبي FP7 على نطاق واسع متكامل شبكة (HEALTH-241995) إلى AS. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |