Deux algorithmes d'analyse d'images, « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été créés, pour quantifier automatiquement neuf caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire drosophile (NMJ).
morphologie synaptique est étroitement liée à l'efficacité synaptique, et dans de nombreux cas des défauts synaptiques morphologiques conduisent finalement à un mauvais fonctionnement synaptique. La jonction neuromusculaire des larves de drosophile (NMJ), un modèle bien établi pour synapses glutamatergiques, a été largement étudié depuis des décennies. L'identification de mutations provoquant des défauts morphologiques NMJ a révélé un répertoire de gènes qui régulent le développement des synapses et de la fonction. Un grand nombre d' entre eux ont été identifiés dans des études à grande échelle axés sur des approches qualitatives pour détecter des anomalies morphologiques du NMJ drosophile. Un inconvénient des analyses qualitatives est que de nombreux acteurs subtils qui contribuent à la morphologie NMJ restent probablement inaperçues. Alors que les analyses quantitatives sont nécessaires pour détecter les différences morphologiques plus subtiles, ces analyses ne sont pas encore courante, car ils sont laborieux. Ce protocole décrit en détail deux algorithmes d'analyse d'image "drosophile </em> NMJ Morphometrics » et « drosophile NMJ Bouton Morphometrics », disponible sous forme de macros Fidji compatibles, pour l' analyse morphométrique quantitative, précise et objective de la NMJ drosophile. Cette méthodologie est développée pour analyser les terminaux NMJ immunomarquées avec les marqueurs couramment utilisés Dlg-1 et . Brp de plus, son application plus large à d'autres marqueurs tels que Hrp, Csp et Syt est présenté dans ce protocole Les macros sont en mesure d'évaluer neuf caractéristiques NMJ morphologiques:. zone NMJ, périmètre NMJ, le nombre de boutons, longueur NMJ, NMJ branche la plus longue longueur, le nombre d'îles, le nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives dans le terminal NMJ.
Les troubles cognitifs tels que la déficience intellectuelle, troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont souvent caractérisées par la fonction synaptique anormale 1, 2, 3. la morphologie et la fonction des synapses sont étroitement imbriquées; défauts morphologiques peuvent provoquer un dysfonctionnement synaptique et, inversement, la transmission synaptique aberrante aura un impact sur la maturation synaptique et de la morphologie 4, 5, 6.
Un certain nombre d'organismes modèles ont été utilisés afin de mieux comprendre la biologie des synapses et faire la lumière sur la façon dont les changements affectent synaptiques le fonctionnement du cerveau dans la santé et la maladie 7, 8, 9. Le NMJ Drosophila est un largement étudiée et bien établie dans le modèle in vivo pour glutamatergique synapse biologie 10, 11. Au cours des dernières décennies, ce modèle a été utilisé pour des études physiologiques et génétiques concentré, ainsi que pour les écrans génétiques à grande échelle, dans le but de détecter des différences morphologiques entre NMJs. En particulier, les écrans génétiques avant ont identifié de nombreux organismes de réglementation et des mécanismes sous – jacents cruciaux le développement des synapses et la fonction 12, 13, 14, 15, 16. Cependant, la plupart de ces écrans se est fondé sur une évaluation visuelle de la morphologie terminale NMJ et sur la détection qualitative des anomalies synaptiques ou notation semi-quantitative de quelques caractéristiques morphologiques. En conséquence, plutôt subtiles anomalies morphologiques synaptiques qui ne sont pas visibles à l'œil humain sont facilement passer inaperçus. Afin de pouvoir détecter globalement des différences quantitatives, lesNMJ doit être évaluée avec précision par quantification systématique des paramètres morphologiques d'intérêt. La mesure des caractéristiques NMJ manuellement est laborieuse, en particulier lorsqu'il y a plusieurs caractéristiques NMJ d'intérêt et / ou lors de l'exécution des projections génétiques à grande échelle. Afin de soutenir multiparamétrique, analyse morphologique à haut débit et d'atteindre la quantification objective, deux macros « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été développés 17. Les deux macros fonctionnent dans le logiciel d'analyse d'images open source Fidji 18, et peuvent quantifier les images confocale et nonconfocal.
"Drosophila NMJ morphométrie" mesures bornes NMJ immunocolorées avec le disque de marqueur postsynaptique grand-1 (DLG-1) ou la peroxydase de raifort présynaptique (HRP), co-marquées avec le marqueur de zone active Bruchpilot (Brp). Il quantifie neuf Paramé morphologiqueTER (décrit plus en détail ci – dessous): Surface de la jonction neuromusculaire, le périmètre NMJ, le nombre de boutons, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre d'îles, le nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives dans le terminal synaptique (figure 1) . Bien qu'un algorithme pour déterminer le nombre de boutons est présent dans cette macro, il ne répondait pas aux critères de précision 17. Pour évaluer correctement le nombre de boutons, il est nécessaire d'utiliser la macro « drosophile NMJ Bouton Morphometrics », qui est spécialement conçu pour quantifier boutons à l' aide de préparations NMJ immunocolorées par anti-Synaptotagmin (SYT) ou de la protéine de chaîne anti-Cystéine (Csp), et co-immuno avec Brp. La macro « drosophile NMJ Bouton Morphometrics » quantifie les paramètres suivants: nombre de boutons, zone NMJ de bouton, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre d'îles, nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zo actifnes (Figure 2).
Les macros sont constituées de trois sous-macros: (I) « Autre empiler » identifie tous les fichiers d'image disponibles et crée Z-hyperstacks et les projections d'intensité maximale des deux canaux. En sortie, cette macro va générer deux nouveaux fichiers par synapse appelé « stack_image_name » et « flatstack_image_name ». II) « Définir ROI » ouvrira toutes les images de projection maximale de « flatstack_image_name » consécutivement et les présenter à la demande de définir manuellement la région d'intérêt (ROI) dans laquelle le terminal synaptique spécifique d'intérêt est présent. Ceci a été mis en œuvre pour permettre à l' exclusion des synapses reliant les muscles adjacents et / ou d' autres types de terminaux synaptiques (comme 1s) qui peuvent être présents dans les images 11. (III) « Analyse » applique une analyse entièrement automatisée pour toutes les régions des images à l'intérieur de la ROI. Commeà la suite de cette étape, l'utilisateur obtiendra deux nouveaux fichiers: « Results.txt » où toute la mesure numérique sera annotées et un « res_image_name.tif » où les segmentations d'images sous-jacentes produites par la macro seront illustrées. Au cours de l'analyse d'image de trois structures sont dérivées de chaque terminal synaptique: le contour NMJ, le squelette NMJ, et le nombre de zones actives Brp-positives. Le contour NMJ est utilisé pour déterminer la zone NMJ et son périmètre et une séparation des bassins versants après indique le nombre de boutons. À partir du squelette, cinq caractéristiques NMJ sont déduits: la longueur totale NMJ, la somme de la longueur du plus long trajet continu reliant les deux points d'extrémité (longueur plus longue branche), le nombre de compartiments non connectés par NMJ (dénommé « îlots » ), le nombre de branches, et le nombre de points de ramification (un point de dérivation relie trois branches ou plus). Le nombre de zones actives est déterminée dans le canal en comptant Brptaches Brp positives. Le contour NMJ annoté (ligne jaune), le squelette NMJ (ligne bleue), et le nombre de zones actives Brp-positives (indiqués par les foyers blanc) sont affichés dans un tableau de résultats et les mesures des paramètres sont traités à un (. txt) du fichier de sortie (figure 3).
Drosophila NMJ Morphometrics » et "drosophile NMJ Bouton Morphometrics" ont d' abord été décrits et largement validés par Nijhof et al. 17. Ce manuscrit se concentre sur la méthodologie pour analyser la morphologie NMJ à l' aide des macros "drosophile NMJ Morphométrie" et "drosophile NMJ Bouton Morphométrie". Néanmoins, avant analyses macro assistée, dissections NMJ et immunomarquages doivent être effectuées. Ce sont des étapes cruciales, et la combinaison de marqueurs utilisés pour l'immunohistochimie doit convenir à des analyses macro. Ces étapes sont brièvement mentionnées en soiction 1 de ce protocole et diriger l'utilisateur vers des références décrivant en détail les protocoles d'exécuter ces procédures.
« Drosophile NMJ Morphometrics » et « drosophile NMJ Morphometrics bouton » sont de puissants outils pour les chercheurs intéressés à évaluer la morphologie des synapses. évaluation manuelle des paramètres NMJ est laborieuse; on estime que les macros économiseraient un chercheur expérimenté jusqu'à 15 min / NMJ consacré à la segmentation d'images manuel. Avec une à deux douzaines de synapses évaluées par état ou génotype, cela résume rapidement à des quantités considérables de temps économisé, même dans les études à petite échelle. Lorsque vous effectuez de grands écrans, le gain en utilisant l'analyse à haut débit, par rapport à l'évaluation et la quantification manuelle, peut être immense. En plus de l'augmentation du débit, les macros fournissent facilement une analyse objective; ils excluent les préjugés personnels qui s'y opposent des expériences aveuglés ainsi que les différences interpersonnelles qui se produisent lorsque plusieurs chercheurs sont impliqués dans l'analyse. Enfin, les macros sont un sensible et précisaly des caractéristiques NMJ, permettant l'identification des régulateurs synaptiques qui causent plutôt subtiles que des défauts NMJ dramatiques et ont jusqu'à présent restés incompris par l'œil du chercheur. Des informations détaillées sur les procédures de validation et les algorithmes utilisés dans les macros se trouvent dans la publication Nijhof et al. 17.
La fonctionnalité des macros a été validé pour mesurer de manière appropriée les caractéristiques morphologiques de Drosophila melanogaster NMJs au muscle 4. Ensuite, on a démontré que les macros sont également appropriés pour analyser synapses à d' autres muscles de cet organisme. Il est probable que les macros peuvent également être utilisés pour mesurer les paramètres morphologiques de NMJ avec une structure similaire dans d' autres espèces, y compris d' autres espèces de drosophiles et les insectes autres. Même NMJs très éloignés dans l' évolution, par exemple, NMJs de souris, montrent une conformation structurelle assez similaire 29. Les macros n'ont pas été testées sur des préparations NMJ d'autres espèces, mais les utilisateurs potentiels sont encouragés à tester les macros à ces fins.
Il est très important que l'utilisateur explore les différents seuils d'auto-et algorithmes pour définir / choisir les paramètres macro les plus appropriés pour les images. Avec ces paramètres, on obtient une précision d'environ 95% lors de l'évaluation macro a été comparée à l'évaluation manuelle. Réglage des paramètres macro correctement pour le segment 100% des images peut être une procédure très laborieuse, voire impossible. Par conséquent, l'exclusion des images pas correctement segmentés est recommandée si leur nombre est inférieur à 5%. De toute évidence, si la qualité des images est faible, les macros génèrent des rapports plus élevés de segmentations d'image non satisfaisantes. images de faible qualité influenceront de la même évaluation manuelle et ne peuvent donc pas être lié à la performance des macros. Néanmoins, les macros sont assez robustes car ils ont été conçus pour l'images généré sur un microscope à haute teneur (un microscope à fluorescence automatisé qui permet l' imagerie d' un grand nombre d'échantillons) 17.
Un point critique est que l'utilisateur inspecte visuellement toutes les images de résultats générés par les macros. Cela permettra de détecter et d'exclure des images avec une segmentation peu satisfaisante. Dans l'article 6 de ce protocole, l'utilisateur est guidé comment ajuster les paramètres pour la segmentation d'image correcte lors de l'exécution de la sous-macro « Analyser ». Pour familiariser rapidement avec les exigences des macros et comment régler les paramètres macro un dossier appelé « Examples_adjusting paramètres macro » est inclus dans le référentiel macro https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Treize sous-répertoires, chacun avec des exemples d'images obtenues à différentes plates-formes de microscopie (microscope à haute teneur / confocale / fluorescence) et des différentes immunomarquages, sont fournis. Un PDF intitulé « Guide des exemples » est inclus dans le mêmedossier dans lequel les paramètres requis pour chaque exemple sont fournis, ainsi que d'un document de texte fournissant les résultats attendus et des images de résultats.
Les macros ont été conçues pour traiter les images enregistrées en tant que fichiers séparés .tiff, néanmoins certains utilisateurs ont sauvé leurs images dans un format différent. Le site Web suivant https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 contient un dossier nommé « drosophile NMJ » où trois exemples de fichiers (exemple 1 – 3) et le document « Guide des exemples » avec des instructions détaillées comment importer des images dans la macro sinon stockées sous forme de fichiers .tiff séparés peuvent également être trouvés dans le même dossier.
Ensemble, "drosophile NMJ Morphometrics" et macros "drosophile NMJ Morphométrie" quantifient bouton dix caractéristiques différentes NMJ: zone NMJ, périmètre NMJ, le nombre de boutons, zone NMJ de bouton, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre de islaPDN, nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives. Cela donne un grand avantage sur les outils disponibles à ce jour qui permettent d' évaluer seulement un ou quelques caractéristiques synaptiques 30, 31. Analyse quantitative multiparamétrique porte un grand potentiel pour de nouvelles découvertes, par exemple, pour identifier les régulateurs de nouvelles qui contrôlent un à de nombreux aspects de la biologie des synapses. Il fournit également la résolution requise pour déterminer les gènes qui coregulate exactement les mêmes caractéristiques NMJ ou qui se chevauchent et sont donc susceptibles d'opérer dans les voies moléculaires communes. Enfin, il ouvre la possibilité d'étudier comment les différents paramètres synaptiques sont corrélés entre eux dans des conditions non perturbées 17 et dont les gènes assurent ces corrélations morphométriques coordonnées.
Pris ensemble, ce protocole illustre comment utiliser les deux macros « drosophile NMJ Morphometrics » et« Drosophila NMJ Bouton Morphometrics », qui effectue une quantification objective et sensible de dix caractéristiques morphologiques NMJ d'une manière à haut débit.
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons le centre boursier drosophile Drosophila Resource Center Vienna et Bloomington (NIH P40OD018537) pour fournir des souches de drosophile. Nous remercions Jack Fransen du Centre d'imagerie Microscopie pour le soutien d'experts en imagerie. Cette étude a été soutenue par des subventions et VIDI TOP (917-96-346, 912-12-109) de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), par deux DCN / Université Radboud de bourses de doctorat du Centre médical, par le Réseau arriération mentale allemand financé par le programme NGFN + du ministère fédéral allemand de l'éducation et de la recherche (BMBF) et par la grande échelle de l'Union européenne du 7e PC Gencodys réseau intégré (SANTÉ-241995) à l'AS. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |