Twee beeldanalyse algoritmen, "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).
Synaptische morfologie nauw gerelateerd aan synaptische werkzaamheid en vaak morfologische afwijkingen synaps uiteindelijk tot synaptische defecten. De Drosophila larvale neuromusculaire junctie (NMJ), een gevestigde model voor glutamaat synapsen, is uitgebreid bestudeerd voor decennia. Identificatie van mutaties die NMJ morfologische gebreken bleek een repertoire van genen die synaps ontwikkeling en functie te reguleren. Veel van deze werden geïdentificeerd in grootschalige studies die gericht zijn op de kwalitatieve aanpak van morfologische afwijkingen van de Drosophila NMJ detecteren. Een nadeel van kwalitatieve analyses is dat veel subtiele spelers dragen tot NMJ morfologie waarschijnlijk onopgemerkt. Overwegende dat de kwantitatieve analyses zijn nodig om de subtielere morfologische verschillen op te sporen, zoals analyses zijn nog niet vaak uitgevoerd, omdat ze zijn omslachtig. Dit protocol beschrijft uitvoerig twee beeldanalyse algoritmen "Drosophila </em> NMJ Morfometrie" en 'Drosophila NMJ Bouton Morfometrie', verkrijgbaar als Fiji-compatibel macro's, voor de kwantitatieve, nauwkeurige en objectieve morfometrische analyse van de Drosophila NMJ. Deze methodiek is ontwikkeld om NMJ terminals immunolabeled met de meest gebruikte markers analyseren Dlg-1 en . brp Daarnaast zijn ruimere toepassing op andere merkers zoals Hrp CSP en Syt wordt in dit protocol macro's kunnen negen morfologische NMJ eigenschappen bepalen. NMJ gebied NMJ omtrek aantal boutons, NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones in de NMJ terminal.
Cognitieve stoornissen zoals verstandelijke beperking, autisme spectrum stoornis en schizofrenie worden vaak gekenmerkt door abnormale synaptische functie 1, 2, 3. Synaps morfologie en functie zijn nauw verweven; morfologische defecten synaptische defecten veroorzaken en, omgekeerd, zullen afwijkende synaptische transmissie beïnvloeden synaptische rijping en morfologie 4, 5, 6.
Een aantal model organismen zijn gebruikt om beter te begrijpen synaps biologie en licht werpen op hoe synaptische wijzigingen van invloed zijn hersenfunctie bij gezondheid en ziekte 7, 8, 9. De Drosophila NMJ is een uitgebreid bestudeerd en gevestigde in vivo model voor glutamaat synapse biologie 10, 11. In de afgelopen decennia is dit model gebruikt voor fysiologische en gen gerichte studies, alsook voor grootschalige genetische screens, teneinde morfologische verschillen tussen NMS detecteren. In het bijzonder naar voren genetische screens veel cruciale regulatoren en de mechanismen die ten grondslag liggen synaps ontwikkeling geïdentificeerd en de functie 12, 13, 14, 15, 16. De meeste van deze schermen gebruikt visuele beoordeling van NMJ terminal morfologie en kwalitatieve detectie van de synaptische afwijkingen of semi-kwantitatieve scoring van enkele morfologische kenmerken. Dientengevolge zijn vrij subtiel synaptische morfologische abnormaliteiten die niet duidelijk voor het blote oog gemakkelijk gemist. Om te kunnen kwantitatieve verschillen en is uitgebreid op te sporenNMJ moet nauwkeurig worden geëvalueerd door een systematische kwantificering van de morfologische parameters van belang. Het meten van NMJ functies handmatig is omslachtig, vooral wanneer er meerdere NMJ kenmerken van rente en / of bij het uitvoeren van grootschalige genetische screenings. Om multiparametrische, high-throughput morfologische analyses ondersteunen en objectieve kwantificatie te bereiken twee macros "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" ontwikkeld 17. Beide macro's worden uitgevoerd in de open source software voor beeldanalyse Fiji 18, en kan kwantificeren zowel confocale en nonconfocal beelden.
"Drosophila NMJ Morfologie" maatregelen NMJ terminals immunostained de postsynaptische markeurschijf large-1 (Dlg-1) of het presynaptische mierikswortelperoxidase (HRP), co-gelabeld met de actieve zone marker bruchpilot (Brp). Het kwantificeert negen morfologische Parameters (hieronder verder beschreven) NMJ gebied NMJ omtrek aantal boutons, NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones in de synaptische terminal (figuur 1) . Hoewel een algoritme voor het bepalen van het aantal boutons aanwezig is in deze macro, het niet voldoen aan de criteria voor de nauwkeurigheid 17. Het aantal boutons goed te kunnen beoordelen, is het noodzakelijk om de "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" macro die speciaal is ontworpen om boutons behulp NMJ preparaten immunologisch gekleurd met anti-synaptotagmin (Syt) of anti-cysteïne snaar proteïne (CSP) kwantificeren gebruiken, en co-immunologisch met Brp. De "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" macro meten van de volgende parameters: aantal boutons, NMJ bouton gebied NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve Zones (Figuur 2).
Macro's bestaan uit 3 sub-macros: (I) "Convert stapelen" identificeert alle beschikbare beeldbestanden en creëert Z-hyperstacks en maximale intensiteit projecties van beide kanalen. Als output zal deze macro twee nieuwe bestanden per synaps genaamd "stack_image_name" en "flatstack_image_name" te genereren. II) "Definieer ROI" opeenvolgend open alle maximale projectiebeelden "flatstack_image_name" en reiken het verzoek het interessegebied (ROI) waarin de specifieke synaptische terminal plaats aanwezig is handmatig opgeven. Dit werd uitgevoerd om uitsluiting van synapsen verbinden met aangrenzende spieren en / of andere vormen van synaptische terminals (bijvoorbeeld 1 s) die aanwezig kunnen zijn in de beelden 11 toe. (III) "Analyze" geldt volledig geautomatiseerde analyse om alle delen van de beelden binnen de grenzen van de ROI. Als"Results.txt" waar alle numerieke meting geannoteerd en "res_image_name.tif" wanneer de onderliggende segmentatie door de macro worden toegelicht: Door deze stap wordt de gebruiker beide bestanden te plaatsen. Tijdens beeldanalyse drie structuren zijn afgeleid van elk synaptische terminal: de NMJ overzicht, de NMJ skelet en het aantal Brp-positieve actieve zones. De NMJ omtrek wordt gebruikt om de NMJ stippellijn de omtrek te bepalen en een daaropvolgende afscheiding keerpunt biedt het aantal boutons. Uit het skelet worden vijf NMJ kenmerken afgeleid: de totale NMJ lengte, de som van de lengte van het langste pad dat twee eindpunten (langste scheutlengtes), het aantal niet-verbonden compartimenten per NMJ (aangeduid als "eilanden" ), het aantal vertakkingen en het aantal vertakkingspunten (een aftakpunt verbindt drie of meer vertakkingen). Het aantal actieve zones wordt bepaald in de Brp-kanaal door het tellenBRP-positieve vlekken. De geannoteerde NMJ omtrek (gele lijn), de NMJ skelet (blauwe lijn) en het aantal Brp-positieve actieve zones (aangegeven met witte foci) worden in een resultaat beeld en de metingen van de parameters worden bewerkt om een (. txt) uitvoerbestand (figuur 3).
Drosophila NMJ Morfometrie" en 'Drosophila NMJ Bouton Morfometrie' werden voor het eerst beschreven en uitgebreid gevalideerd door Nijhof et al. 17. Dit handschrift richt zich op de methodologie om NMJ morfologie te analyseren met behulp van de macro's 'Drosophila NMJ Morfometrie' en 'Drosophila NMJ Bouton Morfometrie'. niettemin, voorafgaand aan macro-ondersteunde analyses NMJ ontledingen en immunokleuring uitgevoerd moeten worden. Dit zijn essentiële stappen, en de combinatie van merkers voor immunohistochemie moet geschikt macro analyses worden. Deze stappen worden kort vermeld in sectie 1 van het protocol en richt de gebruiker referenties beschrijven in detail de protocollen voor deze procedures uit te voeren.
"Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ bouton Morfometrie" zijn krachtige instrumenten voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de evaluatie van synaps morfologie. Handmatige evaluatie van NMJ parameters omslachtig; wordt geschat dat de macro's een ervaren onderzoeker zou besparen tot 15 min / NMJ besteed aan handmatige afbeelding segmentatie. Met 1-2 tientallen synapsen geëvalueerd per aandoening of genotype, vat dit al snel tot aanzienlijke hoeveelheden opgeslagen tijd, zelfs in kleinschalige studies. Bij het uitvoeren van grote schermen, de versterking van het gebruik van high throughput analyse, in vergelijking met handmatige beoordeling en kwantificering, kan enorm zijn. Naast de toegenomen doorvoer macro's bieden gemakkelijk objectieve analyse; ze sluiten persoonlijke vooroordelen die anders verblind experimenten en interpersoonlijke verschillen die optreden wanneer meerdere onderzoekers die betrokken zijn bij de analyse vereisen. Ten slotte is de macro's zorgen voor een gevoelig en nauwkeurig eenALYSE NMJ kenmerken, waardoor de identificatie van synaptische regulatoren die leiden plaats subtieler dramatische NMJ gebreken en tot nu toe gebleven ondergewaardeerd door het oog van de onderzoeker. Gedetailleerde informatie over de validatie procedures en de algoritmes gebruikt in de macro's zijn te vinden in de publicatie Nijhof et al. 17.
De functionaliteit van de macro's is gevalideerd om adequaat te meten morfologische kenmerken van Drosophila melanogaster NMJs bij spier 4. Vervolgens werd aangetoond dat de macro's waren ook geschikt voor synapsen naar andere spieren te analyseren in dit organisme. Het is waarschijnlijk dat de macro kan ook worden gebruikt om morfologische parameters van NMJ met gelijke opbouw in andere soorten, met inbegrip van andere soorten Drosophila en andere insecten te meten. Zelfs NMJs heel ver in de evolutie, bijvoorbeeld NMJs van muizen, tonen een vrij gelijkaardig structurele conformatie 29. De macro's zijn niet getest op NMJ preparaten uit andere soorten, maar potentiële gebruikers worden aangemoedigd om de macro's te testen voor dergelijke doeleinden.
Het is zeer belangrijk dat de gebruiker de verschillende auto-drempels en algoritmes verkent te definiëren / kies de meest geschikte macro-instellingen voor de beelden. Met deze instellingen wordt een nauwkeurigheid van ongeveer 95% bereikt wanneer macro assessment werd vergeleken met handmatige beoordeling. de macro-instellingen aan te passen aan de juiste segment 100% van de beelden kan een zeer moeizaam of zelfs onmogelijk procedure. Daarom wordt de uitsluiting van de beelden niet goed gesegmenteerd aanbevolen als hun aantallen lager zijn dan 5%. Blijkbaar, als de kwaliteit van de beelden is laag, de macro's zullen hogere verhoudingen van onbevredigende segmentatie te genereren. Lage kwaliteit beelden zullen op dezelfde manier beïnvloeden handmatige evaluatie en kan daarom niet worden gekoppeld aan de prestaties van de macro's. Toch de macro's zijn nogal robuust als ze zijn ontworpen voor hetTussen gegenereerd op een hoog gehalte microscoop (een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop die beeldvorming van grote aantallen monsters mogelijk maakt) 17.
Een kritisch punt is dat de gebruiker visueel inspecteert alle resultaat beelden gegenereerd door de macro's. Dit zal toelaten op te sporen en uit te sluiten van foto's met onbevredigende segmentatie. In hoofdstuk 6 van dit protocol, wordt de gebruiker geleid hoe u de instellingen voor het correct beeld segmentatie aan te passen bij het uitvoeren van de sub-macro "Analyseren". Om snel vertrouwd te maken met de eisen van de macro's en hoe de macro-instellingen een map met de naam "Examples_adjusting macro-instellingen" aan te passen is opgenomen in de macro repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Dertien submappen, elk met voorbeelden beelden verkregen op verschillende platforms microscoop (hoog gehalte / confocale / fluorescentie microscopen) en verschillende immunokleuring, voorzien. Een PDF getiteld “Voorbeelden gids” is opgenomen in dezelfdemap waar die nodig zijn voor elk voorbeeld instellingen worden voorzien, samen met een tekstdocument het verstrekken van de verwachte resultaten en de resultaten images.
De macro's zijn ontworpen om afbeeldingen die zijn opgeslagen te verwerken als .tiff gescheiden bestanden, toch sommige gebruikers misschien hebben hun foto's in een ander formaat opgeslagen. De volgende website https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 bevat een map met de naam "Drosophila NMJ" waar drie voorbeeld-bestanden (Voorbeeld 1-3) en het document "Voorbeelden Guide" met gedetailleerde instructies hoe beelden in de macro importeren zo niet als .tiff gescheiden bestanden die zijn opgeslagen kan ook worden gevonden in dezelfde map.
Together, "Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ bouton Morfometrie" macro's te kwantificeren tien verschillende NMJ kenmerken: NMJ gebied, NMJ perimeter, aantal boutons, NMJ Bouton gebied, NMJ lengte, NMJ langste tak lengte, het aantal islaNDS, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones. Dit zorgt voor een groot voordeel ten opzichte van tot nu toe beschikbare tools die slechts één of enkele synaptische functies 30, 31 kunnen beoordelen. Multiparametrische kwantitatieve analyse draagt een groot potentieel voor nieuwe ontdekkingen, bijvoorbeeld om nieuwe regulatoren die een tot vele aspecten van de synaps biologie controle te identificeren. Het biedt ook de vereiste resolutie van genen die precies coregulate dezelfde of overlappende NMJ kenmerken en dus zal rijden op gemeenschappelijke moleculaire pathways bepalen. Tenslotte opent de mogelijkheid om te onderzoeken hoe verschillende synaptische parameters correleren met elkaar onverstoorde staat 17 en welke genen zorgen deze gecoördineerde morfometrische correlaties.
Bij elkaar genomen, dit protocol laat zien hoe u de twee macro's gebruiken "Drosophila NMJ Morfometrie" en"Drosophila NMJ Bouton Morfologie", die objectief en gevoelige kwantificatie van tien morfologische NMJ functies uitvoeren in een high-throughput manier.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen het Weense Drosophila Resource Center en Bloomington Drosophila voorraad centrum (NIH P40OD018537) voor het leveren van Drosophila stammen. Wij danken Jack Fransen uit de Microscopische Imaging Center voor deskundige ondersteuning in de beeldvorming. Deze studie werd ondersteund door VIDI en TOP-subsidies (917-96-346, 912-12-109) uit Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), door twee DCN / Radboud Universitair Medisch Centrum PhD beurzen, door de Duitse mentale retardatie Network gefinancierd door de NGFN + programma van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) en door het FP7 grootschalige geïntegreerde netwerk Gencodys van de Europese Unie (HEALTH-241.995) naar AS. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |