두 이미지 분석 알고리즘, "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.
시냅틱 형태는 시냅스 효능에 밀접하게 관련되어, 많은 경우에 형태 학적 시냅스 결함은 궁극적으로 시냅스 오작동을 초래할. 초파리 애벌레 신경 근육 접합부 (NMJ), 글루타메이트 시냅스에 대한 잘 확립 된 모델은 광범위하게 수십 년 동안 연구되어왔다. NMJ 형태 학적 결함을 일으키는 돌연변이의 식별 시냅스 개발 및 기능을 조절하는 유전자의 레퍼토리를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들의 대부분은 초파리 NMJ의 형태 학적 이상을 감지하는 질적 접근 방식에 초점을 맞춘 대규모 연구에서 확인되었다. 질적 분석의 단점은 NMJ 형태에 기여 미묘한 플레이어 가능성이 주목 남아 있다는 것입니다. 정량 분석은 형태 학적 미묘한 차이를 검출하는 데 필요한 반면, 수고가 있기 때문에, 이러한 분석은 일반적으로 아직 수행되지 않는다. 이 프로토콜은 두 상세 이미지 분석 알고리즘의 설명 "초파리 </em초파리 NMJ의 정량적 정확하고 객관적인 형태 학적 분석을 위해 피지 대응 매크로로서 사용할> NMJ Morphometrics "및"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics "이.이 방법은 일반적으로 사용되는 마커 immunolabeled NMJ 단자를 분석하기 위해 개발 굴림-1 . BRP는 또한, 같은 HRP CSP의 및 SYT를 다른 마커의 폭 넓은 응용 프로그램이 프로토콜에 표시되는 매크로는 구 개 형태 NMJ 기능을 평가할 수 있습니다. NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ 길이를 NMJ 긴 지점 길이, 섬의 수, 지점의 수 및 분기점 NMJ 단말의 활성 영역의 수의 수.
이러한 지적 장애, 자폐증 스펙트럼 장애와 같은인지 장애, 정신 분열증은 종종 비정상적인 시냅스 기능 1, 2, 3을 특징으로한다. 시냅스의 형태와 기능은 밀접하게 얽혀있다; 형태 적 결함이 시냅스 오작동을 일으킬 수 있고, 역으로, 비정상적인 시냅스 전달은 시냅스 성숙 및 형태 4, 5, 6에 영향을 미칠 것이다.
모델 생물의 수는 더 나은 시냅스 생물학을 이해하고 시냅스 변화가 건강과 질병 7, 8, 9의 뇌 기능에 미치는 영향을 밝혀하기 위해 사용되어왔다. 초파리 NMJ은 광범위하게 연구하고 글루타메이트 SY에 대한 생체 내 모델에서 잘 확립napse 생물학 10, 11. 지난 수십 년 동안,이 모델은 NMJs 사이의 형태 학적 차이를 감지 할 목적으로,뿐만 아니라 대규모 유전 화면에 대한 생리 학적 유전자에 초점을 맞춘 연구에 사용되어왔다. 특히, 순방향 유전자 스크린 시냅스 개발 기초 많은 중요한 레귤레이터 및 메커니즘을 식별하여 12, 13, 14, 15, 16를 작동 하였다. 그러나, 이러한 화면의 대부분 NMJ 단말기 형태의 시각적 평가 및 정성 시냅스 이상 검출 또는 몇몇 형태 적 특징의 반 정량적 점수에 의존. 결과적으로, 인간의 눈에 비 명백하다 오히려 미묘한 시냅스 형태 학적 이상이 간과하기 쉬운. 위해서하는 것은 포괄적으로 양적 차이는 감지 할 수 있어야합니다NMJ 정확하게 관심의 형태 학적 매개 변수의 체계적인 정량화에 의해 평가되어야한다. 수동으로 NMJ 기능을 측정하는 것은 여러 NMJ 관심의 기능 및 / 또는 대규모 유전 검사를 수행 할 때이있다, 특히 힘든입니다. multiparametric 높은 처리량 형태소 해석을 지원하기 위해 객관적 정량을 달성하기 위해, 두 매크로 "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics는"17 개발되었다. 두 매크로는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 피지 (18)에서 실행, 모두 공 초점 및 nonconfocal 이미지를 정량화 할 수 있습니다.
"초파리 NMJ Morphometrics"방안은 큰 1 시냅스 마커 디스크 (굴림-1) 또는 연접 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)로 면역 염색 NMJ 단자는 활성 영역 마커 bruchpilot (BRP)와 CO는 표지. 그것은 구 형태 parame을 정량화TERS (이하에서 설명) NMJ 영역 NMJ 경계, 튼스 수, NMJ 길이 NMJ 긴 분기 길이, 섬의 수, 지점의 수, 분기점 및 시냅스 말단 활성 영역 번호의 수 (도 1) . 튼스의 수를 결정하는 알고리즘이 매크로에 존재하지만, 정확성 (17)에 대한 기준을 충족하지 않았다. 적절 튼스의 수를 평가하기 위해, 특별히 반대 Synaptotagmin (SYT를) 또는 항 시스테인 문자열 단백질 (CSP)으로 면역 염색 NMJ 제제를 사용 튼스 정량화하도록 설계된 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"매크로를 사용할 필요가있다, 및 BRP와 공동 immunolabeled. 은 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"매크로는 다음과 같은 매개 변수를 정량화 : 활성 ZO의 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 섬의 수, 지점 수, 분기 지점의 수와 수를NES (도 2).
매크로 3 서브 매크로 구성 : (I)는 "스택 변환"모든 가능한 이미지 파일을 식별하고, Z-hyperstacks 두 채널의 최대 강도 예측을 생성한다. 출력으로,이 매크로는 "stack_image_name"와 "flatstack_image_name"라고 시냅스 당 두 개의 새로운 파일을 생성합니다. II) "ROI 정의"를 연속하여 모두 최대 투영 화상 "flatstack_image_name을"수동으로 열어 관심의 특정 시냅스 단말이 존재하는 관심 (ROI)의 영역을 정의하는 요청들을 제공한다. 이것은 이미지 (11)에 존재할 수있는 인접한 근육 및 / 또는 (예를 들면 1 초 등) 시냅스 말단 다른 유형의 시냅스 연결의 배제를 허용하도록 구현 하였다. (III) "분석"완전히 ROI의 경계 내에서 이미지의 모든 지역에 분석을 자동으로 적용합니다. 같이모든 측정 수치가 주석 될 "RESULTS.TXT"및 매크로에 의해 생성 된 원본 영상 분할이 설명 될 것이다 "res_image_name.tif"이 단계의 결과, 사용자는 두 개의 새로운 파일을 구하는 것이다. NMJ 윤곽은 NMJ 골격과 BRP-양극 활성 영역의 수 : 화상 분석 중에 세 구조는 각각의 시냅스 말단으로부터 유도된다. NMJ 개요는 NMJ 영역과 경계를 결정하기 위해 사용되며, 후속 유역 분리 튼스의 수를 제공한다. 골격에서 다섯 개 NMJ 기능이 도출된다 : 총 NMJ 길이, 두 끝점을 연결하는 가장 긴 연속 경로의 길이의 합 (긴 가지 길이), NMJ 당 연결되지 않은 구획의 수를 ( "섬"이라 ), 브랜치 수 및 분기점 (하나 개의 분기점이 세 개 이상의 분기 접속)의 수. 활성 영역의 수를 카운트하여 BRP 채널의 판단BRP 양성 명소. (주석 NMJ 윤곽 (황색 선)은 NMJ 골격 (청색 라인) 및 (백색 병소로 표시) BRP-양극 활성 영역의 개수는 결과 영상에 표시되는 상기 파라미터의 측정은로 처리된다. TXT) 출력 파일 (도 3).
초파리 NMJ Morphometrics "및"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics 초파리 NMJ Morphometrics "및"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics ""제 설명 광범위 Nijhof 외. (17)에 의해 확인되었다.이 논문은 매크로를 사용 NMJ 형태를 분석하는 방법에 초점을 맞추고있다. " 그럼에도 불구하고, 매크로를 이용한 분석에 앞서, NMJ 해부 및 immunostainings은 이러한 중요한 단계이다. 수행해야하고, 면역 조직 화학에 사용되는 마커의 조합은 매크로 분석에 적합 할 필요가있다. 이러한 단계를 간략하게 언급되어있는 SE이 프로토콜 ction 1, 이러한 절차를 실행하도록 상세히 설명 프로토콜을 참조로 사용자를 안내.
"초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ 부통 Morphometrics은"시냅스 형태의 평가에 관심이 연구자를위한 강력한 도구입니다. NMJ 매개 변수의 수동 평가는 힘든 것입니다; 이 매크로는 15 분에 숙련 된 연구원을 절약 할 것으로 추정된다 / NMJ 수동 영상 분할에 보냈다. 조건 또는 유전자형에 따라 평가 시냅스 1 ~ 2 수십, 이것은 신속하게 아주 작은 규모의 연구에서, 저장 시간의 상당한 양을 요약한다. 대형 화면을 수행 할 때, 수동 평가 및 정량화에 비해 높은 처리량 분석을 사용할 때의 이득은 엄청난 수있다. 증가 된 처리량에 더하여, 매크로 용이 객관적인 분석을 제공한다; 그들은 그렇지 않으면 눈을 멀게 실험뿐만 아니라 여러 연구자가 분석에 관여 할 때 발생하는 대인 관계의 차이를 필요로 개인 편견을 제외 할 수 있습니다. 마지막으로, 매크로는 민감하고 정확한을 제공극적인 NMJ 결함보다는 미묘한 원인이 지금까지 연구자의 눈에 의해 진가를 인정받지 못한 남아있는 시냅스 규제의 식별을 허용 NMJ 기능 alysis. 검증 절차 및 매크로에 사용되는 알고리즘에 대한 자세한 정보는 게시 Nijhof 등의 알에서 발견된다. (17).
매크로의 기능을 적절하게 근육이어서 4에 초파리 melanogaster의 NMJs의 형태 적 특징을 측정하기 위해 확인 된, 상기 매크로이 유기체의 다른 근육에 시냅스를 분석하기에 적합 있다고 입증되었다. 이 매크로는 다른 초파리 종과 더 곤충을 포함한 다른 종의 유사한 구조와 NMJ의 형태 학적 매개 변수를 측정 할 수있는 가능성이 높습니다. 진화에 매우 먼 심지어 NMJs는, 예를 들면, 마우스의 NMJs는 매우 유사한 구조 형태를 보여 (29). 매크로는 다른 종에서 NMJ 준비에 테스트하지 않은 있지만, 잠재적 인 사용자는 이러한 목적으로 매크로를 테스트하는 것이 좋습니다.
사용자가 / 정의 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 선택할 수있는 다양한 자동 임계 값 및 알고리즘을 탐구하는 것이 매우 중요합니다. 매크로 평가는 수동 평가 비교할 때 이러한 설정으로, 약 95 %의 정확도가 얻어진다. 매크로 설정을 조정하면 제대로 세그먼트는 이미지의 100 %가 매우 힘든 또는 불가능 절차가 될 수 있습니다. 그들의 수는 5 % 이하 경우에 따라서 적절하게 분할되지 이미지를 배제하는 것이 좋습니다. 이미지의 품질이 낮 으면 분명히, 매크로는 만족스럽지 못한 영상 분할의 높은 비율을 생성합니다. 낮은 품질의 이미지는 유사하게 수동 평가에 영향을 미칠 것이다, 따라서 매크로의 성능에 링크 할 수 없습니다. 그들은 이미지 설계된대로 그럼에도 불구하고 매크로 오히려 견고높은 함량 현미경 (17) (샘플의 다수의 이미지를 허용하는 자동 형광 현미경) s의 생성.
중요한 점은 사용자가 시각적으로 매크로에 의해 생성 된 모든 결과의 이미지를 검사한다는 것이다. 이것은 감지하고 만족스럽지 분할로 사진을 제외 할 수 있습니다. 이 프로토콜 (6)에서, 사용자는 "분석"서브 매크로 실행시 정확한 이미지 분할의 설정을 조정하는 방법에 대해 안내된다. 빠르게 매크로의 요구 사항 및 방법 매크로 설정 "매크로 설정을 Examples_adjusting"라는 폴더를 조정하는 방법에 익숙해 매크로 저장소 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a에 포함되어 있습니다. 예제 (고 함량 / 촛점 / 형광 현미경) 다른 현미경 플랫폼에서 얻어진 화상과 다른 immunostainings 열세 하위 각각이 제공된다. PDF 파일 권리 "예 가이드는"동일한에 포함되어 있습니다각 예제에 필요한 설정이 예상 결과와 결과 이미지를 제공하는 텍스트 문서와 함께 제공되는 폴더.
매크로는 티파니 파일을 분리로 저장된 이미지를 처리하도록 설계되었습니다, 그럼에도 불구하고 일부 사용자는 다른 형식으로 자신의 이미지를 저장 한 수 있습니다. 상세한 지침 문서 "예 안내서"어떻게 매크로로 이미지를 가져 – 다음 웹 사이트 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a (21)는 세 개의 예제 파일 (3 예 1) "초파리 NMJ"라는 이름의 폴더가 티파니 분리 된 파일로 저장되지 않은 경우도 같은 폴더에서 찾을 수 있습니다.
NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 이슬라 번호 : 함께 "초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ 부통 Morphometrics"매크로는 10 개 개의 다른 NMJ 기능을 정량화NDS, 지점의 수, 분기점의 수 및 활성 영역의 수. 이것은 단지 하나 또는 몇 시냅스 기능 (30), (31)을 평가할 수 있습니다 지금까지 사용 가능한 도구를 통해 큰 장점을 제공한다. Multiparametric 정량 분석은 시냅스 생물학의 여러 측면까지를 제어하는 새로운 규제를 식별하기 위해 새로운 발견, 예를 들어,에 대한 큰 잠재력을 맺는다. 또한 동일 또는 중복 NMJ 기능을 coregulate 따라서 일반적인 분자 경로에서 작동 할 가능성이 유전자를 결정하는 데 필요한 해상도를 제공합니다. 마지막으로, 유전자 시냅스 파라미터는 조정 된 형태 학적 상관 관계를 확인 교란 조건 (17)으로 서로 상호 얼마나 다른지 조사 할 수있는 가능성을 연다.
함께 찍은,이 프로토콜은 "초파리 NMJ Morphometrics"두 매크로를 사용하는 방법을 보여줍니다 및고 처리량 방법으로 열 개 형태 NMJ 기능 대물 민감한 정량화를 수행 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics".
The authors have nothing to disclose.
우리는 초파리 균주를 제공하기 위해 비엔나 초파리 리소스 센터 및 블루밍턴 초파리 재고 센터 (NIH P40OD018537)을 인정합니다. 우리는 영상 전문가 지원을 위해 대한 현미경 이미징 센터에서 잭 프랜슨합니다. 이 연구는 독일의 정신 지체 네트워크에 의해, 두 DCN / Radboud 대학 의료 센터의 박사 장학금으로, VIDI 및 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 TOP 보조금 (917-96-346, 912-12-109)에 의해 지원되었다 교육 및 연구 (BMBF)의 독일 연방 정부의 NGFN + 프로그램 및 AS에 대한 유럽 연합의 FP7 대규모 통합 네트워크 Gencodys (건강-241995)에 의해 투자. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |