Évaluation initiale des anticorps-conjugués modifié avec Peptides viraux dérivés pour accroître l’Accumulation cellulaire et améliorer le ciblage tumoral

Summary

Peptides dérivés d’origine virale, couplées à l’anticorps-conjugués (ACs) est une approche gagne du terrain en raison du risque de fournir des charges moléculaires avec accumulation de cellules de tumeur accrue. Utilisant des méthodes communes pour évaluer la conjugaison de peptide, AC et accumulation intracellulaire de charge utile et le ciblage de la tumeur, ce protocole permet aux chercheurs pendant les phases clés du développement initial.

Abstract

Scientifiques (ACs) modifiées avec des peptides dérivés de virus sont une classe potentiellement puissante d’agents de prestation de cellule de tumeur pour charges moléculaires utilisés dans le traitement du cancer et d’imagerie en raison de l’accumulation cellulaire accrue au cours de l’actuelle ACs. Au cours du début AC in vitro développement, techniques de fluorescence et des dosages radioimmunologiques ne suffisent pas pour déterminer la localisation intracellulaire et l’efficacité de l’accumulation spécificité cellulaire cible. Actuellement, il n’y a pas de consensus sur les méthodes normalisées pour la préparation des cellules pour évaluer la localisation et l’accumulation intracellulaire de l’AC. L’essai initial des ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus est critique, surtout si plusieurs candidats ont été construits. Déterminer l’accumulation intracellulaire de fluorescence peut être affectée par le signal de fond de l’ACs à la surface cellulaire et compliquer l’interprétation d’accumulation. Pour des dosages radioimmunologiques, cellules généralement traitées sont fractionnés et mesuré la radioactivité dans des compartiments cellulaires différentes. Cependant, lyse cellulaire varie de cellule en cellule et souvent nucléaires et cytoplasmiques des compartiments ne sont pas suffisamment isolées. Ceci peut produire des données trompeuses sur les propriétés de remise des charges utiles. L’injection intraveineuse de radiomarquées virus dérivés peptide modifié ACs en tumeur portant souris suivies par scintigraphie est une méthode puissante pour la détermination des propriétés de tumeur ciblage et charge utile de livraison lors de la phase in vivo des développement. Toutefois, il s’agit d’un avancement relativement récent et peu de groupes ont évalué virus dérivés des ACs peptide modifié de cette manière. Les auteurs décrivent le traitement des cellules traitées afin d’évaluer plus précisément virus dérivés l’accumulation AC peptide modifié lors de l’utilisation des dosages radioimmunologiques et microscopie confocale. Plus précisément, une méthode pour cellules trypsinisation d’enlever la surface de la cellule liée ACs. Nous fournissons également un procédé d’amélioration de fractionnement cellulaire. Enfin, ce protocole fournit une méthode in vivo à l’aide de la tomographie par émission de positrons (PET) pour l’évaluation de la tumeur primitive ciblant les propriétés chez des souris de tumeur-roulement. Nous utilisons le radio-isotope ⁶⁴Cu (t_1/2 = h 12,7) comme une charge d’exemple dans le présent protocole.

Introduction

Scientifiques (ACs) sont des produits biopharmaceutiques qui arrivent à échéance dans une classe transformatrice des médicaments efficaces pour l’amélioration des traitements contre le cancer et pour la détection des tumeurs. Composé d’un anticorps monoclonal (ACM), conjugué à des charges utiles moléculaires comme radio-isotopes, les petites molécules et toxines biologiques, ACs sont en mesure de livrer ces charges utiles aux cellules cancéreuses avec exquis cible l’antigène affinité et spécificité. Ainsi ACs peuvent considérablement réduire la toxicité non spécifique et augmenter l’activité de la charge utile sur le site de la tumeur. Thérapeutiquement, ACs transport cytotoxiques petites molécules (communément appelé conjugués anticorps-médicament) ont été approuvés pour le traitement des patients atteints de cancer du sein et le lymphome de Hodgkin qui n’ont pas les traitements conventionnels ^{1, 2}. en outre, ACs transport radio-isotopes (communément appelé radioimmunoconjugates) sont également en développement. Une AC transportant un radio-isotope pour l’imagerie est approuvé pour l’identification des métastases de cancer de la prostate ³. Avec beaucoup plus thérapeutique ACs soumis pour approbation ⁴, optimisme est élevé pour l’avenir de l’ACs pour améliorer les soins de cancer ⁵.

Néanmoins, lors de la remise des agents chimiothérapeutiques ou radio-isotopes, ACs peinent à accumuler efficacement ces charges à l’intérieur des cellules cibles. Cet aspect contribue de manière significative dans de nombreux cas dans l’incapacité de l’ACs pour fournir la survie sans maladie de longue durée ou une tumeur de contraste élevé d’imagerie ^6,7. En général, une fois que l’ACs lier leur antigène cible ils sont internalisées par un processus appelé endocytose. L’ACs sont ensuite pris au piège à l’intérieur des endosomes et victimes de la traite vers les lysosomes pour dégradation et charge utile de sortie ⁸. Le processus de trafic intracellulaire pose des défis pour les pays candidats d’atteindre une spécificité élevée de charge utile et l’efficacité contre cibler les cellules cancéreuses. Par exemple, de nombreux antigènes comme Her2 (cible pour l’AC thérapeutique Trastuzumab-emtasine) peut recycler jusqu’à 85 % des anticorps fixés dans le premier 30 min ⁹. En outre, une fois que la dégradation se produit, agents chimiothérapeutiques libéré et radio-isotopes activement exportables par augmentation de l’expression ou l’activité de transport de membrane associée protéines ^10,11. Dégradation du lysosome empêche également la livraison de nouvelles charges biologiques tels que des enzymes thérapeutiques et oligonucléotides qui peuvent être désactivé ^12,13. En substance, la cellule cancéreuse est très efficace pour abroger la nécessaire accumulation intracellulaire de charges utiles par ACs.

Ce protocole décrit comment implémenter le concept de ACs-couplée à des peptides dérivés de virus, spécifiquement pour échapper endosome provocation policière et localisation pour le noyau de la cellule. Avec une telle sophistication pour manipuler les systèmes de cellules hôtes, il n’est pas surprenant que le développement des virus dérivés de protéines et de peptides comme potentiel biopharmaceuticals a longtemps été enraciné dans la recherche thérapeutique ¹⁴. Des millions d’années, les virus ont évolué pour acquérir une collection exceptionnelle de protéines capables d’exploiter efficacement les systèmes cellulaires de mammifères physiologiques normales afin d’entrer dans les cellules de l’hôte. Pour les virus qui sont internalisés par endocytose, elles sont également contestées s’enfuient trafic vers les lysosomes où l’assaut d’une concentration localisée de protéases peut s’avérer problématique pour la survie. Un peptide viral dérivé bien caractérisé utilisé drug delivery pour échapper endosome provocation policière est le virus de l’immunodéficience humaine de transactivateur de transcription (Tat) protéine ¹⁵. Tat est en mesure d’échapper endosome provocation policière en détectant à quel point les changements de conformation de protéines produisent Tat propice pour s’en insérer et perturber le de membrane endosomale ¹⁶pH faible. Il en résulte des conjugués de Tat-charge utile peuvent accéder le cytoplasme. Le deuxième élément de manipulation virale lié au présent protocole est l’approche utilisée pour livrer des gènes thérapeutiques et médicaments au noyau ¹⁷. Les virus ont évolué pour manipuler avec succès des machines de cellule hôte pour progresser au-delà de la membrane nucléaire en passant par le complexe du pore nucléaire (NPC). Macromolécules cellulaires contiennent (ou se lier aux protéines qui contiennent) des signaux de localisation nucléaire (sln) nécessaires pour la liaison nucléaire à transportent protéines (p. ex. karyophérines α et β), qui fournissent les mouvements requis par le biais de la NPC. Les virus ont mis au point des protéines pour contenir des séquences NLS qui leur fournissent la possibilité d’utiliser des protéines de transport de cellules hôtes pour faire la navette dans le noyau de ¹⁸.

ACs nombreux ont précédemment été fonctionnalisés avec des peptides dérivés Tat – et NLS et testés pour leur capacité à s’accumuler à l’intérieur des cellules cancéreuses et pour cibler les tumeurs ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (tableau 1). Études offrant des charges utiles cytotoxiques ont démontré que les ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus sont capables d’augmenter considérablement l’accumulation cellulaire, la cytotoxicité et tumeur tuant plus non modifié ACs ^22,26. Une caractéristique commune pour cette nouvelle classe d’AC est leur construction. En général, les peptides contiennent une cystéine terminale fournissant un groupe sulfhydryle libre. MAbs sont tout d’abord réagis avec un noncleavable de reticulation bifonctionnels contenant N– hydroxysuccinimide (NHS) et maléimide groupes aux extrémités opposées. Les esters de NHS réagissent avec des amines primaires sur le mAb forment des liaisons amide. Le CCG ont réagi avec groupes maléimide gratuit puis réagit avec les groupes sulfhydryles sur les peptides pour former une liaison thioester et reliant ainsi le peptide et mAb. Bien que les agents réticulants homobifunctional ont été utilisés ²⁸, hétérobifonctionnel RETICULATION sont plus couramment utilisés dans la construction des virus dérivés peptide-ACs ^{22,23,26, 31,32}. Ce protocole utilise spécifiquement la RETICULATION sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-CCAP) pour sa facilité d’utilisation et parce qu’il est utilisé dans le conjugués anticorps-médicament approuvé Trastuzumab-emtasine et dans de nombreux peptide-ACs virus dérivés ^{8,22,23,26,31,32}. Sur gel de polyacrylamide de sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) est la principale méthode pour déterminer initialement efficacité de conjugaison et semi de quantifier le nombre de peptides par mAb. Microscopie confocale utilisant un anticorps secondaire marqué fluorescent spécifique à la mAb est généralement la méthode d’évaluation au départ des propriétés de distribution intracellulaire de virus dérivés peptide modifié ACs. Jusqu’à présent, les radioisotopes sont charges du primaires envoyées par virus dérivés peptide modifié ACs. Radioisotopes sont avantageux car la radioactivité dans les cellules est facilement quantifiée en comptant les gamma. En outre, ACs qui sont traduites dans des modèles murins de cancers humains fournir aux chercheurs la possibilité d’évaluer le ciblage tumoral en utilisant des modalités d’imagerie moléculaires telles que d’émission monophotonique calculé tomographie par émission de positrons (TEP) ^{23 , 32 , 33}. en général, la construction et la validation méthodes principalement utilisé par les chercheurs offrent une très bonne évaluation des ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus pendant la phase de développement initial d’entrer et de distribuer de manière efficace la charge utile à l’intérieur de cellules cibles et aux tumeurs de la cible.

Tat et NLS-modifié ACs ont illuminé les domaines clés pour améliorer encore la livraison de la charge utile à l’intérieur des cellules cancéreuses et tumeurs. En ce qui concerne la NLS-modifié ACs, l’efficacité dans l’accumulation intracellulaire peut être modeste ^23,31,,³⁴. Inefficace accumulation intracellulaire est causée par la provocation policière endosomale continue. In vivo ciblage tumoral peut également être diminué avec les deux Tat et NLS-modifié ACs. Les séquences actives de Tat et NLS contiennent plusieurs résidus chargés positives. Lorsqu’il est attaché à l’ACM, la charge globale cationique peut être significativement accru de ³⁵. En conséquence, le Tat et NLS-modifiés ACs ont augmenté l’absorption dans les tissus sains et a augmenté la clairance sanguine rapide.

Notre groupe a développé un composé composite comprenant de l’acide cholique lié à NLS (ChAcNLS ; La figure 1). ACs ChAcNLS modifiés sont capables d’augmenter l’accumulation intracellulaire de radio-isotopes livrés et améliorer le ciblage tumoral par rapport aux traditionnels et NLS-modifié ACs ^33,34. Le mécanisme derrière l’acide cholique est inspiré par la capacité de certains virus nus qui ne peut s’appuyer sur la fusion membranaire d’utiliser de l’acide cholique pour déclencher l’endosome évasion par le biais de la formation de céramide. Par exemple, virus entériques porcine recrute l’acide cholique qui active la sphingomyélinase, qui catalyse l’hydrolyse de la sphingomyéline en céramide ^36,37,38. Cela déstabilise la membrane endosomale et permet pour l’évacuation de virus. Ainsi, l’acide cholique est un autre composant dérivé de virus qui complète NLS.

Comme ce champ se déplace vers l’avant et l’avenir avancements se produisent dans la livraison de la charge utile par ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus, il est opportun de faire la démonstration visuelle de leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles au cours du développement initial. Nous décrivons ici notre protocole pour l’évaluation initiale du virus dérivé ACs peptide modifié pour la détermination simple mais efficace d’accumulation intracellulaire et ciblage tumoral au cours du développement de la scène. Nous utilisons le mAbs commercialement disponible 7 3 et A14 comme systèmes modèles exemple. Procédure 1 décrit l’utilisation de SDS-PAGE, comme une méthode qui permet de « go/no go » des décisions pour ACs construite. Procédure 2 décrit une méthode utilisant la trypsinisation permettant une meilleure visualisation de la distribution intracellulaire de AC et accumulation. Procédure 3 décrit une méthode pour améliorer fractionnement intracellulaire à déterminer avec précision la localisation nucléaire. Dans cette procédure, nous utilisons la charge utile ⁶⁴Cu (t_1/2 = h 12,7) parce qu’il est vulnérable à l’efflux cellulaire et est un émetteur de positrons ¹⁰. Ainsi, la procédure 4 décrit en vivo tumeur ciblant la caractérisation par PET imaging pour visualiser la captation de la tumeur par rapport au fond (c’est-à-dire les tissus sains) et de déterminer si l’exemple AC peut précisément et efficacement tumeurs de la cible. Ces méthodes ne suffisent pas pour développer ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus pour identifier des candidats plus de promotion pour les enquêteurs.

Protocol

En vivo animaux expériences décrites ont été effectuées selon un protocole approuvé et dans les directives éthiques du Comité d’éthique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke pour l’expérimentation animale. 1. anticorps Peptide conjugaison Remarque : ChAcNLS peut être synthétisé à tout fabricant de peptide commercial ou de la plate-forme de service de synthèse peptidique affilié à l’Université. La synthèse de ChAcNLS se tr…

Representative Results

Pour la procédure 1, la construction de 7 3 modifié avec ChAcNLS à l’aide de sulfo-CCAP comme une RETICULATION est très fiable. En règle générale, lorsque chargées sur un gel de 12 % et analysés par SDS-PAGE, il en résulte une augmentation progressive distinguables proportionnelle à l’augmentation des ratios de sulfo-CCAP – 7 3 MW utilisée et permet pour les chaînes lourdes et légères être évaluée individuellement pour ChAcNLS conjugaison (Figure 3)….

Discussion

Principaux objectifs de délivrance systémique d’agents anticancéreux doivent accroître l’accumulation sur le site de la tumeur et l’absorption dans les cellules cancéreuses et diminuer les effets secondaires indésirables dans les tissus sains. Livraison de AC ciblée de charges utiles moléculaires de cellules tumorales est une approche très prometteuse pour traiter et de détecter des tumeurs. Toutefois, le manque d’efficacité causée par piégeage de l’endosome et vers le bas de dégradation lysosomal…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771