세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Summary

바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말 (ACs)에 결합 된 증가 된 종양 세포 축적과 분자 페이로드를 제공의 가능성으로 인해 기세를 얻고입니다. 펩 티 드 활용, AC 및 페이로드 세포내 축적, 및 종양을 대상으로 평가 하는 일반적인 방법을 활용 하 고,이 프로토콜 연구원 주요 초기 개발 단계에서 도움이 됩니다.

Abstract

항 체-어원이 같은 말 (ACs) 바이러스 파생 된 펩 티 드로 분자 페이로드 암 치료에 사용 되 고 현재 ACs에 증가 세포 축적 때문 이미징에 대 한 종양 세포 배달 에이전트의 잠재적으로 강력한 클래스는. 초기 AC에 체 외에서 동안 개발, 형광 기술 및 방사는 세포내 지역화, 축적, 효율과 대상 세포 특이성을 결정 하기 위한 충분 한. 현재, AC 세포내 축적 및 지역화에 대 한 셀을 준비 하기 위한 표준화 된 방법에 아무런 합의입니다. ACs를 바이러스 파생 된 펩 티 드로의 초기 테스트 하는 것이 여러 후보를 생성 하는 경우에 특히 중요 합니다. 세포내 축적 결정 형광 세포 표면에 ACs에서 배경 신호에 의해 영향을 받을 수와 축적의 해석을 복잡 하 게. 방사, 일반적으로 치료 세포는 분류 한 및 다른 세포 격실에 방사능 측정. 그러나, 세포 세포의 용 해 셀을 변화 하 고 종종 핵과 세포질 구획 적절 하 게 격리 됩니다. 이 페이로드 배달 속성에 잘못 된 데이터를 생성할 수 있습니다. 방사선된 바이러스 파생 된 펩 티 드 수정 ACs 종양 마우스 뒤에 방사성 핵 종 영상 베어링에서 정 맥 주입의 비보에 단계에서 종양 타겟팅 및 페이로드 배달 속성을 결정 하기 위한 강력한 방법 이다 개발입니다. 그러나, 이것은 비교적 최근의 발전 하 고 몇 그룹 펩 티 드 수정 ACs를 바이러스 파생이 방식으로 평가 했습니다. 우리는 더 정확 하 게 평가 하는 펩 티 드 수정 AC 축적 바이러스 파생 confocal 현미경 검사 법 및 방사를 사용 하는 경우에 치료 셀의 처리를 설명 합니다. 특히, trypsinizing 세포 세포 표면 제거 하는 방법 ACs 바인딩됩니다. 우리는 또한 세포 분별 법을 개선 하기 위한 방법을 제공 합니다. 마지막으로,이 프로토콜이 있습니다 vivo에서 양전자 방출 단층 촬영 (PET)를 사용 하 여 초기 종양 종양 방위 쥐에서 속성을 대상으로 평가. 우리가 사용 하는 방사성 ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 h)이 프로토콜에서 예제 페이로드로.

Introduction

항 체 어원이 같은 말 (ACs)는 효과적인 약물 암 치료 향상을 위한과 종양의 transformative 클래스에 성숙 하는 바이오. 단일 클론 항 체 (mAb) radioisotopes, 작은 분자 및 생물 독 소 같은 분자 페이로드를 활용의 구성, ACs 절묘 한 대상 항 원 친화성 및 특이성 암 세포에 이러한 페이로드를 전달할 수 있습니다. 따라서 ACs을 크게 줄이고 특이 독성 종양 사이트에서 페이로드 활동 증가 가능성이 있다. 치료로, 세포 독성 작은 분자 (일반적으로 언급 항 체 약 변화)를 수송 하는 ACs 기존의 치료 ^1, 실패 한 유방암 및 Hodgkin의 림프 종 환자 치료에 대 한 승인 되었습니다. ². 또한, ACs 수송 radioisotopes (일반적으로 radioimmunoconjugates 라고 함)는 또한 개발. 이미징에 대 한 방사성 동위 원소를 수송 하는 AC 전립선 암 전이 ³식별을 위해 승인 된다. 많은 더 치료 acs 승인 ⁴에 대 한, 암 치료 ⁵개선에 ACs의 미래에 대 한 낙관론은 높다.

그럼에도 불구 하 고, chemotherapeutics 또는 radioisotopes 제공 때 ACs 대상 셀 안에 이러한 페이로드를 효과적으로 축적 하는 어려움이 있다. 이 부분 상당히 오랫동안 질병-무료 생존 또는 고대비 종양 ^6,7이미지를 제공 하는 ACs의 무 능력에서 많은 경우에 공헌 한다. 일반적으로, 일단 ACs 바인딩할 그들의 대상 항 원 수용 체 중재 된 endocytosis 이라는 프로세스를 통해 내는 그들은. ACs는 다음 endosomes 안에 갇힌 저하에 대 한 리소좀에 인신 매매 및 페이로드 발표 ⁸. 세포내 밀매 과정 높은 페이로드 특이성 및 대상 암 세포에 대 한 효능을 ACs에 대 한 도전 포즈. 예를 들어 많은 항 Her2 등 (대상 치료 AC Trastuzumab-emtansine)는 첫 번째 30 분 ⁹에 바인딩된 항 체의 85%를 재생할 수 있다. 또한, 저하 발생 하면 출시 된 chemotherapeutics와 radioisotopes 내보낼 수 있습니다 적극적으로 증가 식 및/또는 관련 된 막 수송 단백질 ^10,11의 활동. 리소좀 저하 또한 소설 생물 페이로드 치료 효소 등의 납품을 방해 하 고 수 있는 oligonucleotides 비활성화 ^12,13. 본질적으로, 암 세포 abrogating 페이로드 ACs에 의해 전달의 필요한 세포내 축적에 매우 효과적입니다.

이 프로토콜에서는 ACs-바이러스 파생 된 펩 티 드, 특히 endosome 함정을 탈출 하 고 세포 핵에 지역화에 대 한 결합의 개념을 구현 하는 방법을 설명 합니다. 호스트 셀 시스템 조작 같은 세련미와는 잠재적인 바이오로 바이러스 파생 단백질 및 펩 티 드의 개발은 오래 되었습니다에 배어 든 치료 연구 ¹⁴놀라운 일이 아니다. 바이러스 단백질에 정상 생리 포유류 세포 시스템을 효과적으로 이용할 수 있는 뛰어난 컬렉션을 얻으려고 진화 하는 년의 수백만 대 한 호스트 셀을 입력 합니다. 바이러스 수용 체 중재 된 endocytosis를 통해 내 면, 그들은 또한 프로 테아의 지역화 된 농도의 공격 생존에 대 한 문제가 될 수 있는 매매는 리소좀에 이스케이프와 도전 됩니다. 특징이 잘 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 endosome 함정 탈출을 위한 약물 전달에 활용은 전사 (문신) 단백질 ¹⁵의 인간 면역 결핍 바이러스 transactivator 이다. 문신은 낮은 pH 이때 단백질 구조적 변화가 활성화 문신 자체에 삽입 하 고 endosomal 막 ¹⁶방해를 감지 하 여 endosome 함정을도 주 할 수 있습니다. 이 결과 세포질 액세스할 수 문신 페이로드 어원이 같은 말. 이 프로토콜에 관련 된 두 번째 바이러스 성 조작 요소 핵 ¹⁷에 치료 유전자와 약물을 전달 하는 데 사용 하는 접근 이다. 바이러스는 성공적으로 복잡 한 핵 공 (NPC)를 통과 하 여 핵 막 과거 진행에 대 한 호스트 셀 기계 조작에 진화 했다. 세포질 고분자 포함 (또는 포함 하는 단백질을 바인딩할) 핵에 바인딩하는 데 필요한 핵 지 방화 신호 (NLSs) 수송 단백질 (예: karyopherins α와 β), NPC 통해 필요한 움직임을 제공 하는. 바이러스는 호스트 셀 전송 단백질 핵 ¹⁸에 왕복에 대 한 활용 하는 기능 들을 제공 하는 NLS 시퀀스를 포함 하는 단백질을 개발 했습니다.

수많은 ACs 이전 문신 및 NLS 파생 된 펩 티 드와 공업화 되었고 암 세포 안에 축적 하는 그들의 능력에 대 한 고 종양 ^{19,20,,2122 를 대상으로 테스트 23,,2425,26,27,28,29,30} (표 1). 세포 독성 페이로드를 제공 하는 연구 ACs 바이러스 파생 된 펩 티 드로 세포 축적, 세포 독성, 그리고 수정 되지 않은 ACs ^22,26이상 죽이고 종양을 크게 증가 시킬 수 있습니다 설명 했다. AC의 소설이 클래스에 대 한 일반적인 특징은 그들의 건설 이다. 일반적으로, 펩 티 드 무료 sulfhydryl 그룹을 제공 하는 터미널 시스테인 포함. MAbs는 처음 N-hydroxysuccinimide (NHS)와 반대 끝에 maleimide 그룹을 포함 하는 noncleavable bifunctional crosslinker로 반작용 했다. NHS 에스테 르 아 미드 유대를 형성 하는 mAb에 1 차 아민으로 반작용 한다. 무료 maleimide 그룹으로 반작용된 mAb 다음 sulfhydryl 그룹 펩 티 드 thioester 유대와 이렇게 연결 하는 펩 티 드 및 mAb 형성에 반작용 했다. 비록 homobifunctional crosslinkers는 사용된 ²⁸, heterobifunctional crosslinker는 더 일반적으로 바이러스 파생 된 펩 티 드-ACs ^{22,,2326의 건설에 사용 되 31,32}. 이 프로토콜은 특히 crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) 사용 하 여 cyclohexane-1-카복실산 (sulfo SMCC) 사용의 용이성에 대 한 승인 된 항 체 약물 어원이 Trastuzumab-emtansine에 많은 사용 되 고 바이러스 파생 된 펩 티 드-ACs ^{8,22,23,26,,3132}. 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)가 처음 활용 효율성을 결정 하기 위한 기본 방법에 대 한 반 측정 mAb 당 펩 티 드의 수. Confocal 현미경 검사 법을 붙일 표시 된 이차 항 체는 mAb에를 사용 하 여 일반적으로 처음 바이러스 파생 된 펩 티 드 수정 ACs의 세포내 분포 속성을 평가 하기 위한 방법입니다. 지금까지, radioisotopes 기본 페이로드를 바이러스 파생 된 펩 티 드 수정 ACs에 의해 전달 되는. Radioisotopes 셀에 방사능은 쉽게 감마를 계산 하 여 정량 때문에 유리 하다. 또한, 인간의 암 마우스 모델으로 번역 하는 ACs 종양 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영과 양전자 방출 단층 촬영 (PET)와 같은 분자 이미징 modalities를 사용 하 여 대상으로 평가 하는 능력 연구원 제공 ^{23 , 32 , 33}. 건설 및 연구자에 의해 주로 사용 되는 메서드를 테스트 하는 유효성 검사 효과적으로 입력 하 고 제공 바이러스 파생 된 펩 티 드와 함께 초기 개발 단계에서 수정 하는 ACs의 매우 좋은 평가 제공 하는 일반적으로 페이로드 대상 셀 내부와 대상 종양입니다.

문신 및 NLS-수정 ACs 추가 페이로드 배달 암 세포 내부와 종양을 개선 하기 위한 조명된 핵심 지역이 있다. NLS 수정 ACs에 관하여 세포내 축적에 효율성 겸손 ^23,,3134수 있습니다. 비효율적인 세포내 축적은 지속적인된 endosomal 함정에 의해 발생 합니다. Vivo에서 종양을 대상으로 수 있습니다 또한 줄어들와 두 문신 및 NLS-수정 ACs. 문신 및 NLS의 활성 시퀀스 여러 긍정적인 충전된 잔류물을 포함합니다. MAbs에 연결 된, 전체 양이온 충전 크게 증가 ³⁵수 있습니다. 결과적으로 문신 및 NLS-수정 ACs 건강 한 조직에 통풍 관을 증가 있고 급속 한 혈액 클리어런스를 증가.

우리의 그룹 개발 복합 화합물 cholic acid NLS (ChAcNLS;에 연결 구성 그림 1)입니다. ChAcNLS 수정 ACs 배달된 radioisotopes의 세포내 축적을 증가 및 종양 NLS 수정 및 전통적인 ACs ^33,34에 비해 대상으로 향상 시킬 수 있습니다. Cholic 산 뒤에 장치는 막 퓨전 세 라마 이드의 형성을 통해 endosome 탈출 하 cholic acid를 활용 하는 것에 의존할 수 없는 선택 nonenveloped 바이러스의 능력에 의해 영감 이다. 예를 들어 돼지 장 바이러스 sphingomyelinase, 세 라마 이드 ^36,,3738에 sphingomyelin의 가수분해를 catalyzes 활성화 cholic acid를 보충 한다. 이 endosomal 막 destabilizes 고 바이러스 탈출에 대 한 수 있습니다. 따라서, cholic acid NLS를 보완 하는 다른 바이러스 파생 된 구성 요소입니다.

이 필드 이동 앞으로 미래의 발전 그것은 초기 개발 하는 동안 그들의 생 화 학적 및 기능적 특성의 시각적 데모를 제공 하는 적시 페이로드 전달 바이러스 파생 된 펩 티 드로 ACs에 의해 발생 합니다. 여기, 우리는 세포내 축적 및 종양 초기 단계 개발 대상으로 효율적인 아직 간단한 결정에 대 한 펩 티 드 수정 ACs 바이러스 파생의 초기 평가 대 한 우리의 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 상용 mAbs 7G 3 및 A14 예제 모델 시스템으로 사용합니다. 절차 1 생성 된 ACs에 대 한 ‘ go/no가 ‘ 결정에 대 한 허용 하는 방법으로 SDS 페이지를 사용 하 여를 설명 합니다. 프로시저 2 trypsinization AC 세포내 분포와 축적의 향상 된 시각화에 대 한 허용을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 절차 3 핵 지역화가 정확 하 게 결정을 향상 된 세포내 분별 하는 방법을 설명 합니다. 이 절차에서는 우리가 활용 페이로드 ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 h) 셀룰러 경과에 취약 하 고 양전자가 미터 ¹⁰때문에. 따라서, 절차 4 종양 vivo에서 애완 동물 이미지 배경 (즉 nontarget 건강 한 조직) 기준으로 종양 글귀를 시각화 하 고 AC 예를 구체적으로 그리고 효과적으로 할 수 있는지 여부를 확인 하 여 특성화를 대상으로 설명 대상 종양입니다. 이 메서드는 추가 발전에 대 한 후보를 식별 하기 위해 바이러스 파생 된 펩 티 드로 ACs를 개발 하는 수 사관에 대 한 충분 한.

Protocol

Vivo에서 동물 실험 설명 동물 실험 센터 Hospitalier 대학 드 룩 윤리 위원회의 윤리 지침에 따라 승인 된 프로토콜에 따라 수행 했다. 1. 항 체 펩 티 드 활용 참고: ChAcNLS 상업적인 펩 티 드 제조 업체 또는 대학 제휴 펩 티 드 종합 서비스 플랫폼에서 합성 될 수 있습니다. ChAcNLS의 합성 기준 34에서 찾을 수 있습니다. 절차 1과 2에 대 한 ?…

Representative Results

절차 1, 7G 3의 건설 한 crosslinker는 매우 안정적인 sulfo SMCC를 사용 하 여 ChAcNLS로 수정. 일반적으로, 12% 젤에 로드 하 고 의해 SDS 페이지 분석,이 결과 구별할 수 stepwise MW sulfo SMCC-7G 3 비율 증가에 비례 증가에 사용 및 개별적으로 ChAcNLS에 대 한 평가를 무 겁 고 가벼운 사슬에 대 한 허용 활용 (그림 3)입니다. 7 G 3는 10, 20, 25, 그리고 50 대 1 sulfo SMCC-7G 3 비율 Rf 측정, 3…

Discussion

항 암 제의 조직 배달의 주요 목표는 종양 사이트 및 통풍 관 암 세포 내에 축적을 증가 하 고 건강 한 조직에 원치 않는 부작용을 감소를. 종양 세포에 분자 페이로드 AC 타겟 배달 치료 종양을 검출 하는 매우 유망한 접근 이다. 그러나, 효 험의 부족 endosome 함정으로 인 한 고 스트림 lysosomal 저하 아래로 남아 중요 한 도전. 이 프로토콜 ChAcNLS 펩 티 드를 활용 하 여 차세대 ACs의 건설에 대 한 예를 들…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771