Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert
Summary
Viral-abgeleitete Peptide gekoppelt an Antikörper-Konjugate (ACs) ist ein Ansatz, der Schwung durch das Potenzial der molekularen Nutzlasten mit erhöhten Tumor Zelle Ansammlung zu liefern. Gängige Methoden zur Bewertung Peptid Konjugation, AC und Nutzlast intrazelluläre Akkumulation und Tumor gezielt nutzen, unterstützt dieses Protokoll Forscher während der wichtigen ersten Entwicklungsphasen.
Abstract
Antikörper-Konjugate (ACs) modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind eine potentiell mächtige Klasse von Tumor Zelle Zusteller für molekulare Nutzlasten verwendet in der Krebsbehandlung und Bildgebung durch erhöhten zellulären Akkumulation über aktuelle ACs. Während des frühen AC in Vitro sind Entwicklung, Fluoreszenztechniken und Radioimmunoassays ausreichend zur Bestimmung intrazelluläre Lokalisation, Anhäufung Effizienz und Ziel Zelle Spezifität. Derzeit gibt es keinen Konsens über standardisierte Verfahren zur Herstellung von Zellen für die Bewertung der AC intrazelluläre Akkumulation und Lokalisierung. Die ersten Tests der ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide ist kritisch, vor allem, wenn mehrere Kandidaten gebaut wurden. Bestimmung von intrazellulären Akkumulation durch Fluoreszenz Hintergrundsignal von ACs an der Zelloberfläche betroffen Sie sein können und erschweren Sie die Interpretation der Akkumulation. Für Radioimmunoassays in der Regel behandelte Zellen fraktioniert und die Radioaktivität in andere Zelle Fächer gemessen. Jedoch Zelle Lysis variiert von Zelle zu Zelle und oft Kern- und zytoplasmatischen Kompartimente sind nicht ausreichend isoliert. Dies kann irreführende Daten über Nutzlast Lieferung Eigenschaften führen. Die intravenöse Injektion des radioaktiven Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs im Tumor mit Mäusen gefolgt von Radionuklid Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode für die Bestimmung der Tumoreigenschaften targeting und Nutzlast Lieferung während der in-Vivo -Phase des Entwicklung. Aber dies ist eine relativ neue Zuführung und einige Gruppen haben Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs auf diese Weise ausgewertet. Wir beschreiben die Verarbeitung der behandelten Zellen genauer bewerten Virus abgeleitet Peptid-modifizierte AC Akkumulation bei der konfokalen Mikroskopie und Radioimmunoassays Verwendung. Eine Methode zur trypsinizing Zellen, Zellenoberfläche entfernen gebunden insbesondere ACs. Wir bieten auch eine Methode zur Verbesserung der zellulären Fraktionierung. Dieses Protokoll sieht schließlich eine in-Vivo -Methode mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) für die Bewertung der ersten Tumor gezielt Eigenschaften in Tumor-tragenden Mäusen. Wir verwenden das Radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) als ein Beispiel Nutzlast in diesem Protokoll.
Introduction
Antikörper-Konjugate (ACs) sind Biopharmazeutika, die in eine transformative Klasse von wirksamen Medikamenten zur Verbesserung der Krebs-Behandlungen sowie zur Erkennung von Tumoren fällig sind. Bestehend aus ein monoklonaler Antikörper (mAb) konjugiert, molekulare Nutzlasten wie Radioisotope, kleine Moleküle und biologische Toxine, ACs sind in der Lage, diese Nutzlasten an Krebszellen mit exquisiten Ziel Antigen Affinität und Spezifität zu liefern. Damit ACs haben das Potenzial, deutlich reduzieren unspezifische Toxizität und Nutzlast Aktivität bei der Tumor-Website zu erhöhen. Therapeutisch, wurden ACs Transport von zytotoxischen kleinen Molekülen (gemeinhin als Antikörper-Wirkstoff-Konjugate) zugelassen für die Behandlung von Patienten mit Brustkrebs und Hodgkin Lymphom, die konventionelle Behandlungen 1, gescheitert 2. ACs Transport von Radioisotopen (allgemein als Radioimmunoconjugates bezeichnet) sind darüber hinaus auch in der Entwicklung. Eine AC Transport von Radioisotopen für die Bildgebung ist zur Identifizierung von Prostatakrebs Metastasen 3zugelassen. Mit vielen mehr therapeutische ACs Zulassung 4beantragt ist Optimismus für die Zukunft des ACs zu Krebs Pflege 5hoch.
Dennoch, bei der Chemotherapeutika oder Radioisotope ACs haben Schwierigkeiten, die effektiv sammeln diese Nutzlasten in Zielzellen. Dieser Aspekt trägt wesentlich in vielen Fällen in der Unfähigkeit des ACs zu lang andauernde krankheitsfreien Überlebens oder kontrastreiche Tumor imaging- 6,7. In der Regel sobald ACs binden ihre Ziel-Antigen sind sie durch einen Prozeß bekannt als Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert. ACs sind dann in Endosomen gefangen und verschleppt, Lysosomen für Abbau und Nutzlast release 8. Die intrazelluläre Menschenhandel Prozess stellt Herausforderungen an ACs eine hohe Nutzlast Spezifität und Wirksamkeit gegen Krebszellen zu erreichen. Zum Beispiel viele Antigene wie Her2 (Ziel für therapeutische AC Trastuzumab-Emtansin) kann bis zu 85 % der gebundenen Antikörper in den ersten 30 min 9recyceln. Darüber hinaus nach Verschlechterung auftritt, können freigegebene Chemotherapeutika und Radioisotopen aktiv durch erhöhte Expression/Aktivität der Membran verbundenen Transport Proteine 10,11oder exportiert werden. Lysosomen Abbau hemmt auch die Lieferung der neuartige biologische Nutzlasten wie therapeutischer Enzyme und Oligonukleotide, die sein können deaktiviert 12,13. Im Wesentlichen ist die Krebszelle sehr effektiv bei der Aufhebung der notwendigen intrazellulären Akkumulation von Nutzlasten von ACs geliefert.
Dieses Protokoll beschreibt die Umsetzung des Konzepts der ACs-gekoppelt an Virus-abgeleitete Peptide, speziell für Endosom Verlockende Falle zu entkommen und Lokalisierung in den Zellkern. Mit solcher Raffinesse, Host Zellsysteme zu manipulieren ist es nicht verwunderlich, dass die Entwicklung des Virus abgeleitet Proteine und Peptide als potenzielle Biopharmazeutika lange tief in therapeutische Forschung 14 verwurzelt hat. Seit Millionen von Jahren haben Viren entwickelt, um eine außergewöhnliche Sammlung von Proteinen in der Lage, normale physiologische Säugerzelle Systeme nutzen, um effektiv Wirtszellen geben erwerben. Für Viren, die über Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert werden, stehen sie auch vor der Herausforderung mit Flucht vor Menschenhandel zu den Lysosomen wo kann der Ansturm der eine lokalisierte Konzentration von Proteasen problematisch für das Überleben sein. Eine gut charakterisierten virale abgeleitet Peptid genutzt bei der Medikamentenabgabe zu entkommen Endosom Einklemmung ist das Humane Immundefizienz-Virus Transaktivator Transkription (Tat) Protein 15. Tat ist in der Lage, Endosom Einklemmung durch Sensierung niedrigen pH-Wert an welcher Stelle auftreten, Protein-Konformationsänderungen förderliches Tat sich einfügen und stören die Endosomal Membrane 16zu entkommen. Dies führt zu Tat-Nutzlast Konjugate Zytoplasma zugreifen. Das zweite virale Manipulation Element im Zusammenhang mit diesem Protokoll ist der Ansatz verwendet, um therapeutische Gene und Drogen zum Kern 17liefern. Viren haben entwickelt, um Host Cell Maschinen für voran durch die Kernpore Komplex (NPC) auf der Durchreise vorbei die Kernmembran erfolgreich zu manipulieren. Zelluläre Makromoleküle enthalten (oder binden an Proteine, die enthalten) nukleare Lokalisierung Signale (NLSs) notwendig für die Bindung zu nuklearen transportieren Proteine (z. B. Karyopherins α und β), die die erforderlichen Bewegungen durch den NPC zu bieten. Viren haben Proteine um NLS-Sequenzen enthalten, die ihnen die Fähigkeit, Host Zelle Transportproteine für pendelt in der Kern- 18Nutzen bieten entwickelt.
Zahlreiche ACs haben zuvor mit Tat und NLS-abgeleitete Peptide funktionalisiert und getestet für ihre Fähigkeit, Krebszellen zu sammeln und gezielt Tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tabelle 1). Studien, die Bereitstellung von zytotoxischen Nutzlasten haben gezeigt, dass ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind zellulären Akkumulation, Zytotoxizität und Tumor töten über unveränderte ACs 22,26deutlich erhöhen. Ein gemeinsames Merkmal für diese neuartige Klasse von AC ist konstruktionsbedingt. Peptide enthalten in der Regel ein terminal Cystein bietet eine kostenlose Sulfhydryl-Gruppe. MAbs wird zuerst mit einem Noncleavable bifunktionelle Vernetzer mit N– Hydroxysuccinimide (NHS) und Maleimide Gruppen an den entgegengesetzten Enden reagiert. Die NHS-Ester reagieren mit primären Aminen auf die mAb, Amid-Bindungen zu bilden. Reagierte mAb mit frei Maleimide Gruppen wird dann mit den Sulfhydryl-Gruppen auf die Peptide bilden eine Thioester-Bindung und damit verknüpfen das Peptid und mAb reagiert. Obwohl Homobifunctional Vernetzer verwendet 28gewesen, Heterobifunctional Vernetzer werden häufiger verwendet, in den Bau des Virus abgeleitet Peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Dieses Protokoll verwendet speziell der Vernetzer Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) für seine Benutzerfreundlichkeit und da es in der zugelassenen Antikörper-Wirkstoff-Konjugat Trastuzumab-Emtansin und in vielen verwendet wird Virus-abgeleitete Peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist die primäre Methode zur Bestimmung zunächst Konjugation Effizienz und für semi-Quantifizierung der Anzahl der Peptide pro mAb. Konfokale Mikroskopie mit einer Fluoreszent-markierten Sekundärantikörper spezifisch für die mAb ist in der Regel die Methode zur Bewertung der zunächst intrazelluläre Verteilung Eigenschaften des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs. Radioisotope sind bisher, die primäre Nutzlasten von Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs geliefert. Radioisotope sind vorteilhaft, weil die Radioaktivität in den Zellen leicht durch Gamma zählen quantifiziert ist. Darüber hinaus bieten die ACs, die Maus-Modellen der menschlichen Krebserkrankungen übersetzt werden Forscher mit der Fähigkeit zur Bewertung Tumor gezielt mit molekularen Bildgebungsverfahren wie single Photonenemission Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) berechnet 23 , 32 , 33. die Konstruktion und Validierung Testmethoden, die hauptsächlich von Forschern bietet im Allgemeinen eine sehr gute Bewertung des ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide während der ersten Entwicklungsphase effektiv eingeben und liefern die Nutzlast in Zielzellen und Ziel Tumoren.
Tat – und NLS-modifizierte ACs haben beleuchtete Schlüsselbereichen Nutzlast Lieferung innerhalb Krebszellen und Tumoren weiter zu verbessern. In Bezug auf ACs NLS geändert kann die Effizienz in der intrazellulären Akkumulation bescheidene 23,31,34. Ineffiziente intrazelluläre Ansammlung verursacht durch fortgesetzte Endosomal Einklemmung. Ausrichtung in Vivo Tumor kann auch mit beiden Tat und NLS-modifizierte ACs vermindert werden. Die aktiven Sequenzen von Tat und NLS enthalten mehrere positiv geladene Rückstände. Wenn mAbs angeschlossen, kann die insgesamt kationische Ladung deutlich erhöhte 35sein. Als Folge haben der Tat – und NLS-modifizierte ACs erhöhte Aufnahme in gesundes Gewebe und schnelle Blut Abstand erhöht.
Unsere Gruppe entwickelt eine zusammengesetzte Verbindung bestehend aus Cholsäure verbunden mit NLS (ChAcNLS; ( Abbildung 1). ChAcNLS-modifizierte ACs sind in der Lage zu erhöhen intrazelluläre Akkumulation von gelieferten Radioisotopen und Tumor targeting im Vergleich zu NLS modifiziert und traditionellen ACs 33,34. Der Mechanismus hinter Cholsäure ist inspiriert von der Fähigkeit des ausgewählten nonenveloped Viren, die auf Membranfusion Cholsäure Endosom Flucht durch die Bildung von Ceramid auslösen nutzen nicht verlassen kann. Z. B. Rekruten porcinen enterischen Viren Cholsäure, die Sphingomyelinase, aktiviert die katalysiert die Hydrolyse von Sphingomyelin in Ceramid 36,37,38. Dies destabilisiert Endosomal Membrane und Virus Flucht ermöglicht. Cholsäure ist also ein anderes Virus abgeleitete Komponente, die NLS ergänzt.
Als dieses Feld bewegt sich vorwärts und zukünftige treten Weiterentwicklungen in Nutzlast Lieferung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, es ist ein guter Zeitpunkt, um visuelle Vorführungen ihrer biochemische und funktionelle Eigenschaften während der Anfangsphase der Entwicklung bieten. Hier beschreiben wir unsere Protokoll für die ursprüngliche Bewertung des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs für die effiziente und doch einfache Bestimmung der intrazellulären Akkumulation und Tumor gezielt während der frühen Phase der Entwicklung. Wir verwenden die im Handel erhältlichen mAbs 7 3 und A14 als Beispiel Modellsysteme. Verfahren 1 beschreibt die Verwendung von SDS-PAGE als eine Methode, die für “Go/No go” Entscheidungen konstruierten ACs ermöglicht. Verfahren 2 beschreibt eine Methode, mit Trypsinization für verbesserte Visualisierung von AC intrazelluläre Verteilung und Akkumulation. Verfahren 3 beschreibt ein Verfahren zur verbesserten intrazellulären Fraktionierung, nukleare Lokalisation genau zu bestimmen. In diesem Verfahren nutzen wir die Nutzlast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) weil es anfällig für zelluläre Ausfluss ist und ein Positronen-Emitter- 10 ist. So beschreibt Verfahren 4 in Vivo Tumor targeting Charakterisierung von PET imaging zu visualisieren Tumor Aufnahme relativ zum Hintergrund (d.h. Energiesubventionen gesundes Gewebe) und bestimmen, ob das Beispiel AC gezielt und effektiv kann Ziel Tumoren. Diese Methoden sind ausreichend für die Ermittler, die Entwicklung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, Kandidaten für die Weiterentwicklung zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hauptziele der systemischen Lieferung von Anti-Krebs-Wirkstoffe sind Ansammlung am Tumor Standort und Aufnahme innerhalb von Krebszellen zu erhöhen und unerwünschte Nebenwirkungen bei gesunden Gewebe zu verringern. AC gezielte Bereitstellung von molekularen Nutzlasten für Tumorzellen ist ein sehr vielversprechender Ansatz zur Behandlung und Tumoren zu erkennen. Jedoch die mangelnde Wirksamkeit durch Endosom Einklemmung und down Stream lysosomalen Abbau bleibt eine wichtige Herausforderung. Während dieses Protokoll da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Cancer Research Society (Kanada) und die CIMS finanziert. Die Autoren danken Dr. Samia Ait-Mohand und Jean-Francois Beaudoin um Unterstützung zu erhalten. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) für mAb A14.
Materials
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1-10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
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