Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo
Summary
Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.
Abstract
O epidídimo é um órgão essencial para a maturação do esperma e a saúde reprodutiva. O epitélio epididimétrico consiste em tipos de células intrinsecamente conectados que são distintos, não apenas em características moleculares e morfológicas, mas também em propriedades fisiológicas. Essas diferenças refletem suas diversas funções, que juntos estabelecem o microambiente necessário para o desenvolvimento do esperma pós-testicular no lúmen epidídimo. A compreensão das propriedades biofísicas das células epiteliais epididimais é fundamental para revelar suas funções no esperma e na saúde reprodutiva, em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Embora suas propriedades funcionais ainda não tenham sido totalmente elucidadas, as células epiteliais epididimais podem ser estudadas usando a técnica de patch-clamp, uma ferramenta para medir os eventos celulares e as propriedades da membrana de células isoladas. Aqui, descrevemos os métodos de isolamento celular e gravação de grampos-grampos de células inteiras para meaCom certeza as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato.
Introduction
O epidídimo no trato reprodutivo masculino é um órgão alinhado com uma camada de células epiteliais de mosaico. Como em outros tecidos epiteliais, os vários tipos de células do epitélio epidídmico, incluindo células principais, células claras, células basais e células dos sistemas imunológico e linfático, trabalham de forma concertada para funcionar como a barreira na linha de frente do túnete e como a Células de suporte para a maturação do esperma e fisiologia 1 , 2 , 3 . Assim, essas células epiteliais desempenham um papel essencial na saúde reprodutiva.
As células epiteliais são geralmente consideradas como células não excitáveis que são incapazes de gerar potenciais de ação tudo-ou-nenhum em resposta a estímulos despolarizantes, devido à falta de canais de Na + ou Ca 2+ com tensão gaseada 4 , 5 . No entanto, células epiteliais expressam uniQue conjuntos de canais iônicos e transportadores que regulam seus papéis fisiológicos especializados, como secreção e transporte de nutrientes 6 . Diferentes células epiteliais, portanto, possuem propriedades elétricas características. Por exemplo, as células principais expressam o CFTR para o transporte de fluidos e cloretos e expressam o TRPV6 para a reabsorção de cálcio, enquanto que as células claras expressam a V-ATPase da bomba de protões para a acidificação luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Alguns transportadores e canais iónicos que regulam as características fisiológicas das células epiteliais epididimais têm sido relatados, mas as propriedades funcionais das células epiteliais epididimais ainda não foram ainda compreendidas 10 , 11 , 12 , 13 .
WhA gravação de grampos e grampos de células oleicas é uma técnica bem estabelecida para examinar as propriedades intrínsecas de ambas as células excitáveis e não excitantes e é particularmente útil para estudar as funções de células primariamente dissociadas em amostras de células heterogêneas; A tensão-braçadeira é usada para medir as propriedades da membrana passiva e as correntes iónicas de células simples 14 , 15 . As propriedades da membrana passiva incluem resistência de entrada e capacitância. O parâmetro anterior indica a condutância da membrana intrínseca, enquanto a última implica a área superficial da membrana celular (uma bicamada de fosfolipídios, onde se localizam os canais iónicos e os transportadores, que serve como um isolador fino que separa a mídia extracelular e intracelular). A capacitância da membrana é diretamente proporcional à superfície da membrana celular. Juntamente com a resistência da membrana que é refletida pela resistência de entrada, a constante de tempo da membrana, wO que indica quão rápido o potencial da membrana celular responde ao fluxo de correntes dos canais iónicos, pode ser determinado. A este respeito, ao combinar as características de resposta atuais de uma série de etapas de tensão aplicadas às células, a cinética biofísica e as propriedades das células são determinadas 15 , 16 , 17 , 18 .
No presente trabalho, descrevemos os procedimentos para isolar células epiteliais do epidídimo de cauda de rato e os passos para medir as propriedades da membrana de diferentes tipos de células na mistura de células dissociadas usando o grampo de grampo inteiro. Mostramos que as células principais epididimais apresentam propriedades eletrofisiológicas da membrana distintas e que as condutas podem ser facilmente identificadas a partir de outros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, a dispersão enzimática dos epidídimos de cauda de ratos produziu consistentemente células epiteliais saudáveis. A qualidade das células epiteliais epidídmicas para as experiências de grampos e grampo depende de alguns passos críticos no protocolo. Por exemplo, a centrifugação da mistura celular com baixa força centrífuga (30 xg) é importante para remover os espermatozóides e o conteúdo luminal epidídmico; As células epiteliais epididimais tornam-se pouco saudáveis na presença d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Christopher Antos por comentários úteis sobre o texto. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Universidade ShanghaiTech concedidos a Winnie Shum e pelo financiamento da National Natural Science Foundation of China (NNSFC nº 31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
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