Summary

Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

Published: August 03, 2017
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Summary

Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.

Abstract

O epidídimo é um órgão essencial para a maturação do esperma e a saúde reprodutiva. O epitélio epididimétrico consiste em tipos de células intrinsecamente conectados que são distintos, não apenas em características moleculares e morfológicas, mas também em propriedades fisiológicas. Essas diferenças refletem suas diversas funções, que juntos estabelecem o microambiente necessário para o desenvolvimento do esperma pós-testicular no lúmen epidídimo. A compreensão das propriedades biofísicas das células epiteliais epididimais é fundamental para revelar suas funções no esperma e na saúde reprodutiva, em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Embora suas propriedades funcionais ainda não tenham sido totalmente elucidadas, as células epiteliais epididimais podem ser estudadas usando a técnica de patch-clamp, uma ferramenta para medir os eventos celulares e as propriedades da membrana de células isoladas. Aqui, descrevemos os métodos de isolamento celular e gravação de grampos-grampos de células inteiras para meaCom certeza as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato.

Introduction

O epidídimo no trato reprodutivo masculino é um órgão alinhado com uma camada de células epiteliais de mosaico. Como em outros tecidos epiteliais, os vários tipos de células do epitélio epidídmico, incluindo células principais, células claras, células basais e células dos sistemas imunológico e linfático, trabalham de forma concertada para funcionar como a barreira na linha de frente do túnete e como a Células de suporte para a maturação do esperma e fisiologia 1 , 2 , 3 . Assim, essas células epiteliais desempenham um papel essencial na saúde reprodutiva.

As células epiteliais são geralmente consideradas como células não excitáveis ​​que são incapazes de gerar potenciais de ação tudo-ou-nenhum em resposta a estímulos despolarizantes, devido à falta de canais de Na + ou Ca 2+ com tensão gaseada 4 , 5 . No entanto, células epiteliais expressam uniQue conjuntos de canais iônicos e transportadores que regulam seus papéis fisiológicos especializados, como secreção e transporte de nutrientes 6 . Diferentes células epiteliais, portanto, possuem propriedades elétricas características. Por exemplo, as células principais expressam o CFTR para o transporte de fluidos e cloretos e expressam o TRPV6 para a reabsorção de cálcio, enquanto que as células claras expressam a V-ATPase da bomba de protões para a acidificação luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Alguns transportadores e canais iónicos que regulam as características fisiológicas das células epiteliais epididimais têm sido relatados, mas as propriedades funcionais das células epiteliais epididimais ainda não foram ainda compreendidas 10 , 11 , 12 , 13 .

WhA gravação de grampos e grampos de células oleicas é uma técnica bem estabelecida para examinar as propriedades intrínsecas de ambas as células excitáveis ​​e não excitantes e é particularmente útil para estudar as funções de células primariamente dissociadas em amostras de células heterogêneas; A tensão-braçadeira é usada para medir as propriedades da membrana passiva e as correntes iónicas de células simples 14 , 15 . As propriedades da membrana passiva incluem resistência de entrada e capacitância. O parâmetro anterior indica a condutância da membrana intrínseca, enquanto a última implica a área superficial da membrana celular (uma bicamada de fosfolipídios, onde se localizam os canais iónicos e os transportadores, que serve como um isolador fino que separa a mídia extracelular e intracelular). A capacitância da membrana é diretamente proporcional à superfície da membrana celular. Juntamente com a resistência da membrana que é refletida pela resistência de entrada, a constante de tempo da membrana, wO que indica quão rápido o potencial da membrana celular responde ao fluxo de correntes dos canais iónicos, pode ser determinado. A este respeito, ao combinar as características de resposta atuais de uma série de etapas de tensão aplicadas às células, a cinética biofísica e as propriedades das células são determinadas 15 , 16 , 17 , 18 .

No presente trabalho, descrevemos os procedimentos para isolar células epiteliais do epidídimo de cauda de rato e os passos para medir as propriedades da membrana de diferentes tipos de células na mistura de células dissociadas usando o grampo de grampo inteiro. Mostramos que as células principais epididimais apresentam propriedades eletrofisiológicas da membrana distintas e que as condutas podem ser facilmente identificadas a partir de outros tipos de células.

Protocol

Todos os experimentos com animais são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade Shanghai-Tech, que cumprem os requisitos locais e internacionais. 1. Animais experimentais Use ratos Sprague-Dawley machos adultos (~ 300-450 g) entre 8 a 12 semanas de idade. A esta idade nos ratos, o esperma chegou aos epidídimos da cauda. 2. Isolamento de células epiteliais de Epididímides de Cau…

Representative Results

O procedimento de digestão enzimática descrito para o isolamento de células epiteliais dos epidídimos de cauda de rato é um protocolo modificado de nossos estudos anteriores 9 , 12 . Este método produz uma mistura de células individuais com mais de 90% de viabilidade e sem bolhas de superfície ou volume de células inchadas. A mistura celular heterogênea consiste principalmente de células principais, células claras e c…

Discussion

Neste protocolo, a dispersão enzimática dos epidídimos de cauda de ratos produziu consistentemente células epiteliais saudáveis. A qualidade das células epiteliais epidídmicas para as experiências de grampos e grampo depende de alguns passos críticos no protocolo. Por exemplo, a centrifugação da mistura celular com baixa força centrífuga (30 xg) é importante para remover os espermatozóides e o conteúdo luminal epidídmico; As células epiteliais epididimais tornam-se pouco saudáveis ​​na presença d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Christopher Antos por comentários úteis sobre o texto. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Universidade ShanghaiTech concedidos a Winnie Shum e pelo financiamento da National Natural Science Foundation of China (NNSFC nº 31471370).

Materials

Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices – Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices – Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience – HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

References

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Cite This Article
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

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