Summary

Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis

Published: August 03, 2017
doi:

Summary

Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.

Abstract

De epididymis is een essentieel orgaan voor de rijping van volwassenen en de voortplantingsgezondheid. Het epididymale epithelium bestaat uit ingewikkeld verbonden celtypen die niet alleen verschillen in moleculaire en morfologische eigenschappen maar ook in fysiologische eigenschappen. Deze verschillen weerspiegelen hun uiteenlopende functies, die samen de noodzakelijke micro-omgeving opbouwen voor de ontwikkeling van post-testiculaire sperma in het epididymale lumen. Het begrip van de biofysische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen is cruciaal voor het onthullen van hun functies in sperma en voortplantingsgezondheid, zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden. Hoewel hun functionele eigenschappen nog niet volledig moeten worden opgemerkt, kunnen de epididymale epitheliale cellen worden bestudeerd met behulp van de patch-clamp techniek, een hulpmiddel voor het meten van de cellulaire gebeurtenissen en de membraan eigenschappen van enkele cellen. Hier beschrijven we de methoden van celisolatie en full-cell patch-clamp opname naar meaZeker de elektrische eigenschappen van primaire gedissocieerde epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden.

Introduction

De epididymis in het mannelijke voortplantingsstelsel is een orgaan gevoerd met een laag mosaïcepitheelcellen. Zoals bij andere epitheliale weefsels werken de verschillende celtypes van het epididymale epithelium, inclusief hoofdcellen, duidelijke cellen, basale cellen en cellen uit de immunologische en lymfatische systemen, op een gecoördineerde manier om de barrière aan de voorkant van de buis te functioneren en als Ondersteunende cellen voor sperma rijping en fysiologie 1 , 2 , 3 . Zo spelen deze epitheelcellen een essentiële rol in de reproductieve gezondheid.

Epitheliale cellen worden in het algemeen beschouwd als niet-excitabele cellen die niet in staat zijn om alle of geen actiepotenties te genereren in reactie op depolariserende stimuli, door gebrek aan spanningsgated Na + of Ca 2+ kanalen 4 , 5 . Echter, epitheelcellen drukken uni uitQue sets van ionkanalen en transporteurs die hun gespecialiseerde fysiologische rollen regelen, zoals secretie- en voedingsvervoer 6 . Verschillende epitheelcellen beschikken over karakteristieke elektrische eigenschappen. De hoofdcellen drukken bijvoorbeeld de CFTR uit voor vloeistof- en chloridevervoer en expressie de TRPV6 voor calciumreabsorptie, terwijl de duidelijke cellen de protonpomp V-ATPase uitdrukken voor luminale verzuring 1 , 7 , 8 , 9 . Sommige transporters en ionenkanalen die de fysiologische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen regelen, zijn gemeld, maar de functionele eigenschappen van epididymale epitheelcellen zijn grotendeels nog niet begrepen 10 , 11 , 12 , 13 .

WhOle-cel patch-klem opname is een goed gevestigde techniek om de intrinsieke eigenschappen van beide excitabele en niet-excitabele cellen te onderzoeken en is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de functies van hoofdzakelijk gedissocieerde cellen in heterogene celmonsters; De spanningsclamp wordt gebruikt voor het meten van de passieve membraan eigenschappen en de ionische stromen van enkele cellen 14 , 15 . De passieve membraan eigenschappen omvatten input weerstand en capaciteit. De voormalige parameter geeft de intrinsieke membraanconductie aan, terwijl de laatste het oppervlak van het celmembraan impliceert (een fosfolipide bilayer, waar ionkanalen en transporteurs zich bevinden, die dienen als een dunne isolator die extracellulaire en intracellulaire media scheidt). De membraancapaciteit is direct evenredig aan het oppervlak van het celmembraan. Samen met de membraanweerstand die wordt weerspiegeld door de invoerweerstand, is de membraan tijdconstante, wWat aangeeft hoe snel het celmembraanpotentieel reageert op de stroom van ionenkanaalstromen, kan worden bepaald. In dit verband wordt door de combinatie van de huidige responseigenschappen van een reeks spanningstappen toegepast op de cellen, de biofysische kinetiek en eigenschappen van de cellen bepaald 15 , 16 , 17 , 18 .

In het onderhavige document beschrijven we de procedures voor het isoleren van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymis en de stappen voor het meten van de membraan eigenschappen van verschillende celletypes in het gedissocieerde celmengsel met behulp van de gehele cel patch-klem. We tonen aan dat de epididymale hoofdcellen verschillende membraanelektrophysiologische eigenschappen vertonen en dat de geleiders gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd uit andere celsoorten.

Protocol

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de ShanghaiTech University, die voldoen aan de lokale en internationale eisen. 1. Experimentele dieren Gebruik volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (~ 300-450 g) tussen 8-12 weken oud. Op deze leeftijd in de ratten zijn de sperma in de cauda-epididymiden aangekomen. 2. Isolatie van epitheliale cellen uit Rat Cauda E…

Representative Results

De beschreven enzymatische spijsvertering procedure voor de isolatie van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden is een gemodificeerd protocol uit onze eerdere studies 9 , 12 . Deze methode produceert een mengsel van enkelvoudige cellen met meer dan 90% levensvatbaarheid en zonder oppervlakte blaren of gezwollen celvolume. Het heterogene celmengsel bestaat voornamelijk uit hoofdcellen, duidelijke cellen en basale cellen,…

Discussion

In dit protocol leverde de enzymatische dispersie van de rat-cauda-epididymiden consistente gezonde epitheelcellen. De kwaliteit van de epididymale epitheelcellen voor de patch-clamp experimenten is afhankelijk van een paar kritieke stappen in het protocol. Bijvoorbeeld, de centrifugatie van het celmengsel bij een lage centrifugale kracht (30 xg) is belangrijk voor het verwijderen van de spermatozoa en het epididymale luminale gehalte; De epididymale epitheelcellen worden ongezond in aanwezigheid van de spermatozoa in d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Christopher Antos voor nuttige opmerkingen over de tekst. Dit werk werd ondersteund door startschotfinanciering van de ShanghaiTech University toegekend aan Winnie Shum en door de financiering van de National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).

Materials

Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices – Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices – Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience – HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

References

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).

Play Video

Cite This Article
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

View Video