Summary

خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

Published: August 03, 2017
doi:

Summary

نقدم بروتوكول يجمع بين العزلة الخلية وكل خلية التصحيح المشبك تسجيل لقياس الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية فصلها الابتدائي من البربخ الذيل الفئران. هذا البروتوكول يسمح للتحقيق في الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية البربخ الابتدائي لمواصلة توضيح الدور الفسيولوجي للبربخ.

Abstract

البربخ هو جهاز أساسي لنضج الحيوانات المنوية والصحة الإنجابية. يتكون ظهارة البربخ من أنواع الخلايا المرتبطة بشكل متشابك التي تتميز ليس فقط في الخصائص الجزيئية والمورفولوجية ولكن أيضا في الخصائص الفسيولوجية. هذه الاختلافات تعكس وظائفها المتنوعة، والتي معا إنشاء المكروية اللازمة لتطوير الحيوانات المنوية ما بعد الخصية في التجويف البربخ. فهم الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا الظهارية البربخية أمر بالغ الأهمية للكشف عن وظائفها في الحيوانات المنوية والصحة الإنجابية، في ظل كل من الفسيولوجية والظروف المرضية المرضية. في حين أن خصائصها الوظيفية لم يتم توضيحها بشكل كامل، يمكن دراسة الخلايا الظهارية البربخية باستخدام تقنية التصحيح المشبك، وهي أداة لقياس الأحداث الخلوية وخصائص الغشاء للخلايا المفردة. هنا، نحن تصف أساليب عزل الخلية و خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيل إلى مييتأكد من الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية فصلها الابتدائي من البربخ ذيل الفئران.

Introduction

البربخ في الجهاز التناسلي للذكور هو جهاز اصطف مع طبقة من الخلايا الظهارية الفسيفساء. كما هو الحال في الأنسجة الظهارية الأخرى، وأنواع الخلايا المختلفة من ظهارة البربخ، بما في ذلك الخلايا الرئيسية والخلايا واضحة والخلايا القاعدية والخلايا من النظم المناعية واللمفاوية، والعمل بطريقة منسقة لتكون بمثابة الحاجز في خط أنابيب نبيب، وكما الخلايا الداعمة للنضج الحيوانات المنوية وعلم وظائف الأعضاء 1 ، 2 ، 3 . وهكذا، فإن هذه الخلايا الظهارية تلعب دورا أساسيا في الصحة الإنجابية.

وتعتبر الخلايا الظهارية عموما خلايا غير قابلة للإنجاب التي هي غير قادرة على توليد كل أو لا شيء إمكانات العمل في استجابة لاستقطاب المحفزات، وذلك بسبب عدم وجود الجهد بوابات نا + أو كا 2 + قنوات 4 ، 5 . ومع ذلك، الخلايا الظهارية تعبر يونيكيو مجموعات من القنوات الأيونية والنقل التي تنظم أدوارهم الفسيولوجية المتخصصة، مثل إفراز والنقل المغذيات 6 . وبالتالي فإن الخلايا الظهارية المختلفة تمتلك خصائص كهربائية مميزة. على سبيل المثال، الخلايا الرئيسية تعبر عن كفتر لنقل السوائل والكلوريد والتعبير عن TRPV6 لاستيعاب الكالسيوم، في حين أن الخلايا واضحة تعبر عن مضخة بروتون V-أتباس للحموضة اللمعية 1 ، 7 ، 8 ، 9 . وقد تم الإبلاغ عن بعض شركات النقل وقنوات أيون التي تنظم السمات الفسيولوجية للخلايا الظهارية البربخ، ولكن الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية البربخية لم تفهم إلى حد كبير بعد 10 ، 11 ، 12 ، 13 .

ملحقأولي خلية التصحيح المشبك تسجيل هو تقنية راسخة لفحص الخصائص الجوهرية لكل من الخلايا المنفعلة وغير قابلة للانفجار، ومفيدة بشكل خاص لدراسة وظائف الخلايا في المقام الأول فصل في عينات الخلايا غير المتجانسة. يتم استخدام الجهد المشبك لقياس خصائص الغشاء السلبي والتيارات الأيونية من خلايا واحدة 14 ، 15 . وتشمل خصائص الغشاء السلبي مقاومة المدخلات والسعة. المعلمة السابقة تشير إلى سلوك الغشاء الداخلي، في حين أن الأخير يشير إلى مساحة سطح غشاء الخلية (طبقة ثنائية فوسفورية، حيث توجد القنوات الأيونية والنقل، التي تعمل كعازل رقيق يفصل بين الخلايا خارج الخلية وداخل الخلايا). السعة الغشائية تتناسب طرديا مع مساحة سطح الغشاء الخلوي. جنبا إلى جنب مع المقاومة الغشاء الذي ينعكس من قبل المقاومة المدخلات، ثابت الوقت الغشاء، ثويشير كيف مدى سرعة الغشاء الخلية تستجيب لتدفق التيارات قناة الأيونات، ويمكن تحديد. في هذا الصدد، من خلال الجمع بين خصائص الاستجابة الحالية من سلسلة من الخطوات الجهد تطبيقها على الخلايا، يتم تحديد حركية الفيزيائية الحيوية وخصائص الخلايا 15 ، 16 ، 17 ، 18 .

في هذه الورقة، ونحن تصف إجراءات لعزل الخلايا الظهارية من البربخ ذيل الفئران والخطوات لقياس خصائص الغشاء من أنواع الخلايا المختلفة في خليط الخلية فصل باستخدام خلية كاملة التصحيح المشبك. وتبين لنا أن الخلايا الرئيسية البربخ تظهر خصائص الكهربية الغشاء مميزة وأن المواسير يمكن التعرف عليها بسهولة من أنواع الخلايا الأخرى.

Protocol

يتم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بها وفقا للمبادئ التوجيهية من جامعة شانغهايتيش المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، التي تلبي المتطلبات المحلية والدولية. 1. الحيوانات التجريبية <li style=";text-align:right;…

Representative Results

الإجراء الهضم الأنزيمي وصفها لعزل الخلايا الظهارية من البربخ ذيل الفئران هو بروتوكول معدلة من دراساتنا السابقة 9 ، 12 . هذه الطريقة تنتج خليطا من الخلايا المفردة مع أكثر من 90٪ بقاء ودون بثور سطحية أو تورم حجم الخلية. يت…

Discussion

في هذا البروتوكول، فإن تشتت الأنزيمية من الفئران ذيل البربخ يولد باستمرار الخلايا الظهارية صحية. نوعية الخلايا الظهارية البربخية للتجارب التصحيح المشبك يعتمد على بضع خطوات حاسمة في البروتوكول. على سبيل المثال، الطرد المركزي من خليط الخلية في قوة الطرد المركزي منخف…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور كريستوفر أنتوس على تعليقات مفيدة على النص. وأيد هذا العمل بتمويل من جامعة شانغهاي تك منح ليني شوم وبتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (ننسكف رقم 31471370).

Materials

Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices – Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices – Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience – HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

References

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).

Play Video

Cite This Article
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

View Video