Hele-celle Patch-clamp Opptak av isolerte primære epitelceller fra epididymene
Summary
Vi presenterer en protokoll som kombinerer celleisolasjon og helcelle patch-clamp opptak for å måle de elektriske egenskapene til de primære dissocierte epitelceller fra rotte cauda-epididymider. Denne protokollen tillater undersøkelse av funksjonelle egenskaper til primære epididymepitelceller for å belyse epididymis fysiologiske rolle.
Abstract
Den epididymis er et viktig organ for spermmåling og reproduktiv helse. Det epididymale epitelet består av introduserte celletyper som er tydelige, ikke bare i molekylære og morfologiske egenskaper, men også i fysiologiske egenskaper. Disse forskjellene gjenspeiler deres mangfoldige funksjoner, som sammen etablerer det nødvendige mikromiljøet for utvikling av post-testikulær sperma i det epididymale lumen. Forståelsen av de biofysiske egenskapene til de epididymale epitelceller er kritisk for å avdekke sine funksjoner i sperm og reproduktiv helse under både fysiologiske og patofysiologiske forhold. Selv om deres funksjonsegenskaper ennå ikke har blitt fullstendig uttalt, kan de epididymale epitelceller studeres ved hjelp av patch-clamp-teknikken, et verktøy for måling av de mobile hendelsene og membranegenskapene til enkeltceller. Her beskriver vi metodene for celleisolasjon og full-celle patch-clamp-opptak til megaSikker på de elektriske egenskapene til primære dissocierte epitelceller fra rotte cauda-epididymider.
Introduction
Epididymene i den mannlige reproduktive delen er et organ foret med et lag av mosaikkepitelceller. Som i andre epitelvev, fungerer de forskjellige celletyper av det epididymale epitelet, inkludert hovedceller, klare celler, basale celler og celler fra immunologiske og lymfatiske systemer, på en samordnet måte for å fungere som barrieren ved tubulefronten og som Bærende celler for spermadyring og fysiologi 1 , 2 , 3 . Således spiller disse epitelceller en viktig rolle i reproduktiv helse.
Epitelceller betraktes generelt som ikke-exciterbare celler som ikke er i stand til å generere all-of-none-actionpotensialer som svar på depolariserende stimuli, på grunn av mangel på spenningsgated Na + eller Ca 2+ kanaler 4 , 5 . Imidlertid uttrykker epitelceller uniQue sett av ionkanaler og transportører som regulerer sine spesialiserte fysiologiske roller, som sekresjon og næringsmiddeltransport 6 . Forskjellige epitelceller har derfor karakteristiske elektriske egenskaper. For eksempel uttrykker de primære cellene CFTR for væske- og kloridtransport og uttrykker TRPV6 for kalsiumreabsorpsjon, mens de klare celler uttrykker protonpumpen V-ATPase for luminal surgjøring 1 , 7 , 8 , 9 . Noen transportører og ionkanaler som regulerer de fysiologiske egenskapene til de epididymale epitelceller har blitt rapportert, men de funksjonelle egenskapene til epididymepitelceller er i stor grad ikke forstått 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-celle patch-clamp opptak er en veletablert teknikk for å undersøke de inneboende egenskapene til både ekstreme og ikke-excitable celler, og er spesielt nyttig for å studere funksjonene til primært dissocierte celler i heterogene celleprøver; Spenningsklemmen brukes til å måle de passive membranegenskapene og ionstrømmene av enkeltceller 14 , 15 . De passive membranegenskapene inkluderer inngangsbestandighet og kapasitans. Den tidligere parameter indikerer den indre membranledningen, mens sistnevnte innebærer overflatearealet til cellemembranen (et fosfolipid-dobbeltlag hvor ionekanaler og transportører er plassert, som tjener som en tynn isolator som separerer ekstracellulært og intracellulært medium). Membrankapasitansen er direkte proporsjonal med cellemembranets overflateareal. Sammen med membranmotstanden som reflekteres av inngangsbestandigheten, vil membrantidskonstanten, wSom indikerer hvor raskt cellemembranpotensialet reagerer på strømmen av ionkanalstrømmer, kan bestemmes. I denne forbindelse, ved å kombinere de nåværende responskarakteristikkene fra en serie spenningstrinn som påføres cellene, bestemmes den biofysiske kinetikk og egenskaper av cellene 15 , 16 , 17 , 18 .
I foreliggende papir beskriver vi prosedyrene for isolering av epitelceller fra rotte cauda-epididymis og trinnene for måling av membranegenskapene til forskjellige celletyper i den dissocierte celleblandingen ved anvendelse av helcellepatchklemmen. Vi viser at de epididymale hovedcellene viser forskjellige membranelektrofysiologiske egenskaper og at konduktansene lett kan identifiseres fra andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen ga den enzymatiske dispersjonen av rotte-cauda-epididymider konsekvent sunne epitelceller. Kvaliteten på epididymepitelceller for patch-clamp-eksperimentene er avhengig av noen få kritiske trinn i protokollen. For eksempel er sentrifugeringen av celleblandingen ved en lav sentrifugalkraft (30 xg) viktig for fjerning av spermatozoa og det epididymale luminale innholdet; De epididymale epitelceller blir usunn i nærvær av spermatozoa i cellekulturen. I tillegg er dyrking av den dissocierte celleblan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Christopher Antos for nyttige kommentarer til teksten. Dette arbeidet ble støttet av oppstartsfinansiering fra ShanghaiTech University tildelt Winnie Shum og med finansiering fra National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
