分离的原发性上皮细胞从附睾的全细胞贴片钳记录
1School of Life Science and Technology,ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies,ShanghaiTech University
Summary
我们提出了一种协议，结合细胞分离和全细胞膜片钳记录来测量主要解离的上皮细胞从大鼠cauda附睾的电性质。该方案允许研究原发性附睾上皮细胞的功能特性，以进一步阐明附睾的生理作用。
Abstract
附睾是精子成熟和生殖健康的重要器官。附睾上皮由复杂连接的细胞类型组成，不仅在分子和形态特征上而且在生理特性上都是不同的。这些差异反映了其各种功能，它们共同为睾丸内附睾精子发育建立必要的微环境。了解附睾上皮细胞的生物物理特性对于在生理和病理生理条件下显示其在精子和生殖健康中的功能至关重要。虽然其功能特性尚未完全阐明，附睾上皮细胞可以使用膜片钳技术进行研究，膜技术是测量单细胞的细胞事件和膜性质的工具。在这里，我们描述了细胞分离和全细胞膜片钳记录方法确定主要解离的上皮细胞从大鼠cauda附睾的电性质。
Introduction
男性生殖道的附睾是一层衬有一层马赛克上皮细胞的器官。如在其他上皮组织中，附睾上皮的各种细胞类型，包括主要细胞，透明细胞，基底细胞和来自免疫和淋巴系统的细胞，以协调的方式起作用，作为小管前线的屏障，并且作为支撑为精子成熟和生理学1，2，3的细胞。因此，这些上皮细胞在生殖健康中起重要作用。
上皮细胞通常被视为不可兴奋细胞不能产生响应全或无动作电位去极化到刺激，由于缺乏电压门控Na +或Ca 2+通道4,5。然而，上皮细胞表达uni一组离子通道和转运蛋白调节其特殊的生理作用，如分泌和营养物质运输6 。因此，不同的上皮细胞具有特征的电性质。例如，主细胞表达的CFTR用于流体和氯化运输和表达对钙的重吸收的TRPV6，而明确细胞表达质子泵V-ATP酶对于管腔酸化1，7，8，9。调节附睾上皮细胞的生理特征的一些转运蛋白和离子通道已被报道，但附睾上皮细胞的功能特性在很大程度上尚未了解10，11，12，13。
瓦油细胞膜片钳记录是用于检查可兴奋细胞和不可兴奋细胞的固有特性的已知技术，特别有助于研究异源细胞样品中主要解离的细胞的功能;电压钳用于测量无源膜特性和单电池14，15的离子电流。被动膜性质包括输入电阻和电容。前一个参数表示内在膜电导，而后者则表示细胞膜的表面积（磷脂双层，其中离子通道和转运蛋白位于其中，其作为分离细胞外和细胞内介质的薄绝缘体）。膜电容与细胞膜的表面积成正比。与输入电阻反映的膜电阻一起，膜时间常数w可以确定细胞膜电位对离子通道电流的流动有多快。在这点上，由电流响应特性从一系列施加于细胞电压的步骤相结合，生物物理动力学和细胞的性质被确定15，16，17，18。
在本文中，我们描述了使用全细胞膜片钳从大鼠cauda附睾分离上皮细胞的程序和用于测量解离的细胞混合物中不同细胞类型的膜性质的步骤。我们显示附睾主细胞表现出不同的膜电生理特性，并且可以容易地从其他细胞类型鉴定电导。
Protocol
所有动物实验均按照符合当地和国际要求的上海科技大学机构动物护理与使用委员会的指导方针进行。 实验动物使用8-12周龄的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300-450g）。在大鼠的这个年龄，精子已经到达了马尾附睾。 2.大鼠Cauda上皮细胞的分离注意：除非另有说明，以下步骤在非无菌条件下进行。 准备解剖仪?…
Representative Results
对于上皮细胞从大鼠马尾附睾隔离所描述的酶消化过程是从我们以前的研究9,12一个经修改协议。该方法产生具有超过90％存活力和无表面起泡或肿胀细胞体积的单细胞混合物。异质细胞混合物主要由主要细胞，透明细胞和基底细胞组成，如前所述1 。在该方案中，可以通过在培养皿上培养主要解离细胞过夜以获…
Discussion
在该方案中，大鼠卡达附睾的酶分散始终产生健康的上皮细胞。用于膜片钳实验的附睾上皮细胞的质量取决于方案中的几个关键步骤。例如，在低离心力（30×g）下离心细胞混合物对于去除精子和附睾腔内含量是重要的;附睾上皮细胞在细胞培养中精子存在时变得不健康。另外，在培养皿上培养解离的细胞混合物数小时是去除成纤维细胞和平滑肌细胞的重要步骤;非上皮细胞在培养皿上粘附更快，因…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢Christopher Antos博士对文本的有用评论。这项工作得到了上海科技大学授予温妮·舒姆的启动资金和中国国家自然科学基金资助（NNSFC第31471370号）的资助。
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
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Cite This Article
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).