כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס
Summary
אנו מציגים פרוטוקול המשלב בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק כדי למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל העיקרי ניתק מן epididymides cauda חולדה. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים ראשוניים אפידלימלי נוספת להבהיר את התפקיד הפיזיולוגי של האפידידימיס.
Abstract
האפידידימיס הוא איבר חיוני להבשלת הזרע ולבריאות הרבייה. אפיתל האפידידיום מורכב מסוגי תאים המחוברים בצורה מורכבת, אשר נבדלים לא רק בתכונות מולקולריות ומורפולוגיות אלא גם בתכונות פיזיולוגיות. הבדלים אלה משקפים את הפונקציות המגוונות שלהם, אשר יחד לבסס את microenvironment הצורך לפיתוח זרע שלאחר האשכים ב לומן האפידידימלי. ההבנה של המאפיינים הביופיזיים של תאי האפיתל האפידיאליים היא קריטית לחשיפת התפקודים שלהם בזרע ובבריאות, בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בעוד התכונות הפונקציונליות שלהם עדיין לא הובהר במלואו, תאים epithelial epididymal ניתן ללמוד באמצעות טכניקה טלאי תיקון, כלי למדידת האירועים הסלולר ואת המאפיינים קרום של תאים בודדים. כאן, אנו מתארים את שיטות בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק ל meaבטוח את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל ניתק העיקרי של עכברוש capid epididymides.
Introduction
אברידימיס בדרכי הרבייה הגברי הוא איבר מרופד בשכבת תאים אפיתל פסיפס. כמו ברקמות אפיתל אחרות, סוגי התאים השונים של האפיתל האפידידימלי, כולל תאים ראשיים, תאים ברורים, תאים ותאי בזל מהמערכות החיסוניות והלימפאטיות, פועלים באופן מתואם כדי לתפקד כמחסום בחזית הצינורית וכמו תאים תומכים עבור התבגרות הזרע ופיזיולוגיה 1 , 2 , 3 . לפיכך, תאים אלה אפיתל לשחק תפקיד חיוני בבריאות הרבייה.
תאים אפיתל נחשבים בדרך כלל כמו תאים שאינם נרגשים שאינם מסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה כל או לא בתגובה בתגובה גירויים depolarizing, בשל היעדר מתח מגודרת Na + או Ca 2 + ערוצי 4 , 5 . עם זאת, תאים אפיתל להביע UniQue ערכות של תעלות יונים ו מובילים המסדירים תפקידים פיזיולוגיים מיוחדים שלהם, כגון הפרשת תחבורה המזינים 6 . תאים אפיתל שונים ולכן יש תכונות חשמליות אופייניות. לדוגמה, התאים העיקריים להביע את CFTR עבור התחבורה נוזלים כלור ולהביע את TRPV6 עבור סידן reabsorption, ואילו התאים ברורים להביע את המשאבה פרוטון V-ATPase לחומצה לומינלית 1 , 7 , 8 , 9 . כמה מובילים ערוצי יון המווסתים את התכונות הפיזיולוגיות של התאים אפיתל אפידלימלי דווחו, אבל המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים אפידרלי הם רובם לא הבנתי עדיין 10 , 11 , 12 , 13 .
מהOle-cell-clamp ההקלטה היא טכניקה מבוססת היטב לבחינת התכונות המהותיות של תאים נרגשים ולא נרגשים, והוא מועיל במיוחד עבור לימוד הפונקציות של תאים ניתק בעיקר דגימות הטרוגניות; מתח מהדק משמש למדידת המאפיינים קרום פסיבי וזרמים יוניים של תאים בודדים 14 , 15 . תכונות הממברנה הפסיבית כוללות התנגדות קלט וקיבולת. הפרמטר לשעבר מציין את מוליכות הממברנה המהותית, בעוד שהאחרון מרמז על פני השטח של קרום התא (bilayer phospholipid, שבו נמצאים תעלות יונים ומובילים, המשמש כמבודד דק המפריד בין תאי תאיים ותאיים תאיים). הקיבול של הממברנה הוא פרופורציונלי ישירות על פני השטח של קרום התא. יחד עם התנגדות הממברנה המשתקפת בהתנגדות הקלט, הזמן הקבוע של הממברנה, wHich מציין כמה מהר פוטנציאל קרום התא מגיב לזרימה של זרמי ערוץ יון, ניתן לקבוע. בהקשר זה, על ידי שילוב של מאפייני התגובה הנוכחית מסדרה של צעדים מתח החלים על התאים, הקינטיקה הביופיסיקלית המאפיינים של התאים נקבעים 15 , 16 , 17 , 18 .
במאמר הנוכחי, אנו מתארים את ההליכים לבידוד תאים אפיתל מ עכברוש cauda epididimis ואת הצעדים למדידת המאפיינים קרום של סוגי תאים שונים בתערובת התא ניתק באמצעות מהדק תיקון כל כולו. אנו מראים כי התאים העיקריים האפידידימלי התערוכה מאפיינים שונים electrophysiological קרום וכי מוליכות ניתן לזהות בקלות סוגי תאים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, פיזור אנזימטית של epididymides cauda חולדה בעקביות הניב תאים אפיתל בריאים. איכות התאים אפיתל אפידלימלי עבור ניסויים מהדק תיקון תלוי במספר צעדים קריטיים בפרוטוקול. לדוגמה, צנטריפוגה של תערובת התא על כוח צנטריפוגלי נמוך (30 xg) חשוב להסרת spermatozoa ואת תוכן luminal epididymal; ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר כריסטופר אנטוס על הערות מועילות על הטקסט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מאוניברסיטת שנחאי-טק שהוענק לוויני שום ובמימון הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NNSFC מס '31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
