एपिडीडिमिस से पृथक प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
Summary
हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो चूहा कडा एपिडिडीमाइड से प्राथमिक पृथक उपकला कोशिकाओं के विद्युत गुणों को मापने के लिए कोशिका अलगाव और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग को जोड़ती है। यह प्रोटोकॉल प्राथमिक एपिडिडिमल उपकला कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों की जांच के लिए एपिडीडिमिस की शारीरिक भूमिका को स्पष्ट करने की अनुमति देता है।
Abstract
एपिडीडिमिस शुक्राणु परिपक्वता और प्रजनन स्वास्थ्य के लिए आवश्यक अंग है। एपिडिडिमल एपिथेलियम में गहन रूप से जुड़े सेल प्रकार होते हैं जो न केवल आणविक और रूपवाचक सुविधाओं में ही होते हैं बल्कि शारीरिक गुणों में भी होते हैं। ये मतभेद उनके विविध कार्यों को दर्शाते हैं, जो एक साथ एपिडिडायमल लुमेन में वृषण के बाद के शुक्राणु विकास के लिए आवश्यक microenvironment स्थापित करते हैं। एपिडिडिमल एपिथेलियल कोशिकाओं के बायोफिजिकल गुणों की समझ, शल्यक्रिया और प्रजनन स्वास्थ्य दोनों में शारीरिक और पथभ्रंश दोनों स्थितियों के तहत उनके कार्यों को प्रकट करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि उनके कार्यात्मक गुणों को अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है, एपिडिडीमल एपिथेलियल कोशिकाओं को पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है, एक सेल्यूलर घटनाओं को मापने के लिए एक उपकरण और एकल कोशिकाओं के झिल्ली गुण। यहां, हम सेल अलगाव के तरीकों और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग को मेआ के लिए वर्णन करते हैंयकीन है कि चूहा cauda epididymides से प्राथमिक पृथक उपकला कोशिकाओं के विद्युत गुण
Introduction
पुरुष प्रजनन पथ में एपिडीडिमिस एक अंग है जो मोज़ेक उपकला कोशिकाओं की परत के साथ खड़ा होता है। अन्य उपकला के ऊतकों की तरह, इम्युनोलॉजिकल और लसीका तंत्र से प्रमुख कोशिकाओं, स्पष्ट कोशिकाएं, बेसल कोशिकाएं और कोशिकाओं सहित एपिडिडाइमल एपिथेलियम के विभिन्न प्रकार के कोशिकाओं, ट्यूबू की अग्रिम पंक्ति में बाधा के रूप में कार्य करने के लिए एक ठोस तरीके से काम करते हैं शुक्राणु परिपक्वता और शरीर विज्ञान 1 , 2 , 3 के लिए सहायक कोशिकाएं इस प्रकार, उपकला कोशिकाओं प्रजनन स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।
उपकला कोशिकाओं को आम तौर पर गैर-उत्तेजक कोशिकाओं के रूप में माना जाता है जो वोल्टेज-गेटेड ना + या सीए 2 + चैनल 4 , 5 की कमी के कारण, उत्तेजनाओं को विवरणीकरण के जवाब में सभी-या-कोई भी ऐक्शन क्षमता उत्पन्न करने में असमर्थ हैं। हालांकि, उपकला कोशिकाओं को एकजुट दिखाई देता हैआयन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के सेट जो उनके विशेष शारीरिक भूमिकाओं को नियंत्रित करते हैं, जैसे कि स्राव और पोषक परिवहन परिवहन 6 । विभिन्न उपकला कोशिकाओं में विशेषता विद्युत गुण हैं। उदाहरण के लिए, प्रिंसिपल कोशिकाओं द्रव और क्लोराइड परिवहन के लिए सीएफटीआर को व्यक्त करते हैं और कैल्शियम रीबसॉर्पोरेशन के लिए टीआरपीवी 6 को व्यक्त करते हैं, जबकि स्पष्ट कोशिकाएं ल्यूमोनल अम्लीकरण 1 , 7 , 8 , 9 के लिए प्रोटॉन पंप वी-एटपेस को व्यक्त करती है। कुछ ट्रांसपोर्टर और आयन चैनल जो एपिडिडीमल इपिथियल सेल की शारीरिक विशेषताओं को विनियमित करते हैं, लेकिन एपिडिडीमल एपिथेलियल कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों को काफी हद तक अभी तक 10 , 11 , 12 , 13 नहीं समझा गया है।
कऑल-सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, उत्तेजक और गैर-उत्तेजक दोनों कोशिकाओं के आंतरिक गुणों की जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है, और विषम कोशिका नमूनों में मुख्य रूप से अलग-अलग कोशिकाओं के कार्यों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है; वोल्टेज-क्लैम्प का उपयोग निष्क्रिय झिल्ली गुणों और एकल कोशिकाओं 14 , 15 के आयनिक धाराओं को मापने के लिए किया जाता है। निष्क्रिय झिल्ली गुणों में इनपुट प्रतिरोध और समाई शामिल हैं। पूर्व पैरामीटर आंतरिक झिल्ली प्रवाहकत्त्व को इंगित करता है, जबकि बाद में कोशिका झिल्ली (एक फॉस्फोलिपिड बिलेयर, जहां आयन चैनल और ट्रांसपोर्टर स्थित हैं, जो पतली इन्सुलेटर अलग-अलग और इंट्रासेल्युलर मीडिया को अलग करता है) की सतह क्षेत्र को दर्शाता है। झिल्ली का समाई सीधे सेल झिल्ली के सतह क्षेत्र के आनुपातिक होता है। झिल्ली प्रतिरोध के साथ जो इनपुट प्रतिरोध से परिलक्षित होता है, झिल्ली समय निरंतर, wहाइच संकेत करता है कि आयन चैनल धाराओं के प्रवाह को सेल झिल्ली संभावित प्रतिक्रिया कितनी तेजी से निर्धारित किया जा सकता है। इस संबंध में, कोशिकाओं पर लागू वोल्टेज चरणों की एक श्रृंखला से वर्तमान प्रतिक्रिया विशेषताओं को जोड़कर, कोशिकाओं के बायोफिजिकल कैनेटीक्स और गुण 15 , 16 , 17 , 18 निर्धारित किए जाते हैं।
वर्तमान पत्र में, हम चूहे कौडा एपिडीडिमिस से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं और पूरे सेल पैच-क्लैंप का उपयोग करते हुए पृथक सेल मिश्रण में विभिन्न सेल प्रकारों के झिल्ली गुणों को मापने के लिए कदम। हम दिखाते हैं कि एपिडिडिमल प्रिंसिपल कोशिकाएं अलग-अलग झिल्ली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का प्रदर्शन करती हैं और यह कि संचालन को अन्य सेल प्रकारों से आसानी से पहचाना जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, चूहे कौडा एपिडिडाइड्स के एंजाइमैटिक फैलाव ने स्वस्थ उपकला कोशिकाओं को लगातार मिलाया है। पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए एपिडिडिमल एपिथेलियल कोशिकाओं की गुणवत्ता प्रोटोकॉल में कुछ महत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पाठ पर सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ। क्रिस्टोफर एंटोस का धन्यवाद करते हैं। यह काम शंघाईटेक विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था जो विनी शम को सम्मानित किया गया था और चीन के नैशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (एनएनएसएफसी नंबर 31471370) के वित्त पोषण से।
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
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